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一、概念
MPN计数法（Most Probable Number，最大或然数法）是一种用于估算微生物（如细菌、真菌等）数量的统计学方法，尤其适用于难以直接计数或活菌数较低的样本（如水体、土壤、食品中的微生物检测）。
二、操作步骤
1、梯度稀释：将样本按10倍梯度稀释（如10⁻¹、10⁻²、…、10⁻ⁿ）。
2、接种培养：每个稀释度接种多管（如3管或5管）液体培养基，培养后记录各管的阳性（生长）或阴性（不生长）结果。
3、查表计算：根据阳性管数组合，对照MPN表（预存的统计学表格）得出MPN值，并结合稀释倍数计算原始样本的微生物浓度。
三、稀释梯度设计的核心逻辑
MPN计数法中，稀释梯度和稀释倍数的确定需结合样本特性与检测目标，核心原则是让最终接种管的阳性结果落在“可统计区间”内。关键原则是要确保阳性管数落在“有效统计区间”。下面详细说明梯度稀释无效和有效的几种情况。
（1）无效情况，最低稀释度（如10⁻¹）全阴性或最高稀释度（如10⁻⁶）全阳性都视为无效情况，前者说明稀释倍数过高，样本浓度过低，需降低稀释倍数（如重做10⁰、10⁻¹、10⁻²）。后者说明稀释倍数不足，样本浓度过高，需提高稀释倍数（如加做10⁻⁷、10⁻⁸）。
（2）有效区间，理想的阳性管数组合应满足“最低稀释度全阳，最高稀释度部分阴性”，例如10⁻³（3/3阳性）、10⁻⁴（2/3阳性）、10⁻⁵（1/3阳性），此时可通过MPN表查得准确数值。
稀释梯度的目标是使最高稀释度出现部分阴性管，最低稀释度全为阳性管，例如大肠菌群阳性管和阴性管的判断标准如图1，从而通过阳性管数组合查表计算。
图1 大肠菌群检测时阳性管和阴性管的判断标准
四、稀释倍数的确定方法
1、根据样本预估浓度选择初始稀释倍数
若样本有历史数据（如某类水样大肠菌群通常为10³ CFU/mL），可从10⁻³稀释度开始，向上延伸至10⁻⁵或10⁻⁶，确保最高稀释度有阴性管。
对于未知样本，则采用“试探性稀释”，先做10⁻¹、10⁻³、10⁻⁵三个跨度较大的稀释度，培养后观察阳性管分布，再在有效区间内细化梯度（如若10⁻³全阳性、10⁻⁵全阴性，则重点做10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶）。
2、参考检测标准的固定梯度
如果标准推荐采用10⁻¹、10⁻²、10⁻³三个稀释度，每个稀释度接种3管培养基，这是基于常见样本浓度的标准化设计。如果为环境样本（如土壤），因微生物浓度高，可能从10⁻⁴开始稀释，梯度设为10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶，避免低稀释度下所有管都阳性（无法统计）。
3、依据接种管数量调整稀释倍数
稀释倍数的选择非常重要，为了避免出现实验失误的情况，通常多做几个稀释倍数，同时接种培养，根据结果评估有效稀释倍数。比如，9管法原本只要3个稀释倍数就可以了，我们实际操作的时候，通常多做几个倍数，选取结果比较可取的倍数进行进一步查表确认。
五、确定最适的3个连续稀释度
以10-1～10-55个连续稀释度的MPN计数法为例，按如下方法确定其中最适的3个连续稀释度。
1、有1个及以上的稀释度3管均为阳性
（1）选择3管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的2个更高稀释度（见表示例a、b）；
（2）在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次移到下一更高的3个连续稀释度（见表示例c）；
（3）如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，则将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定3个连续稀释度（见表示例d）；
（4）如果不能按照本规则找到3个合适的稀释度，则从前一个较低的稀释度开始，选择3个连续稀释度（见表示例e）；
2、没有任何1个稀释度3管均为阳性
（5）选择3个最低稀释度（见表示例f）
（6）如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将阳性结果都加到选择的最高稀释度，进而确定3个连续稀释度（见表示例g）。
依据上面的方法，确定出最适合的3个连续稀释度。按照确定的3个数字，进一步查阅MPN表，即可得出样品中的菌数值。
六、实例
以饮用水中大肠菌群检测为例，说明整个检测流程的把握。
1、先判断样本特性，饮用水标准要求大肠菌群≤3 CFU/100mL，浓度低。
2、取100 mL水样直接接种（10⁰），另取10mL水样稀释至100mL（10⁻¹），1mL水样稀释至100mL（10⁻²）；
3、每个稀释度接种3管乳糖胆盐培养基，培养后观察阳性管数；
4、若10⁰（3/3阳性）、10⁻¹（2/3阳性）、10⁻²（0/3阳性），则查表得MPN值为9.3 CFU/100mL。
注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。
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