胎牛血清安全检测-微生物排查指南

  细胞培养基作为体外细胞存活、增殖和功能表达的基础，直接决定了实验的成功率与结果的可靠性。自Earleʹs基础培养基（MEM）与Eagleʹs基础培养基问世以来，众多改良配方相继出现，以满足不同细胞类型对营养、缓冲和生长因子的特定需求。在传统血清补充体系中，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）作为最常见的添加物，不仅提供了生长因子和粘附因子，还在一定程度上缓冲了培养基批次差异带来的影响，但同时也引入了动物福利、伦理和成本问题以及成分不确定性的隐患，在采集与处理环节易被细菌（兼含真菌）、病毒和支原体污染。这些污染不仅会干扰实验，还可能威胁生物制剂与细胞治疗产品的质量与安全，因此必须严格检测。

一、检测对象、危害及检测意义

1.细菌与真菌

  污染源通常来自外界环境、不合格过滤或保存器具，生长性强，易引起培养基浑浊、pH值发生改变，同时会干扰细胞代谢、影响试验结果，严重时导致细胞死亡。

2.病毒

  如牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛呼肠孤病毒（BRV）、牛副流感病毒（BPIV3）、牛疱疹病毒（BoHV）等。这些病毒会严重影响细胞功能及试验重复性、生物制剂安全性，特别是用于制药、疫苗和细胞疗法的FBS品质至关重要。

3.支原体

  支原体无细胞壁、直径极小，难以用普通显微镜或过滤法去除，可长期潜伏于细胞培养体系中；可干扰细胞代谢、转录和蛋白表达，对免疫学和病毒感染等研究影响较大。

二、检测方法

1.细菌与真菌检测

  1.1 经典培养法

  可将FBS接种至含营养的琼脂或液体培养基中（如硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、0.5%葡萄糖肉汤培养基等），分别在有氧和厌氧条件下培养14d-21d。

  1.2 快速无菌检测系统

  使用BacT/ALERT、VIRTUO等智能培养仪进行培养，适用于高通量质控。

2.支原体检测

  2.1 培养与染色法

  使用Frey或Hayflick培养基，在37℃、微需氧环境下培养14d，观察是否出现典型菌落。随后使用Hoechst或DAPI荧光染色，染色后在荧光显微镜下观察细胞周围的支原体DNA斑点。

  2.2 PCR分子检测

  以广谱16S rRNA或特异性引物扩增支原体基因，相较于培养法灵敏度高，24h-48h内可得结果，可与培养/染色法并行，互为补充以提高准确率。

3.病毒检测

  3.1 敏感细胞接种法

  将FBS用于Vero、MDCK等病毒敏感细胞系，连续培养21d，观察细胞病变效应（CPE）及用免疫荧光染色或HE染色确认。

  3.2 免疫学检测

  针对BVDV、BPIV3、BoHV等核心病毒，采用特异性抗体进行酶联或荧光免疫检测，快速筛选常见病原。

  3.3 分子生物学检测（PCR/RT-PCR）

  可用于BVDV、牛腺病毒等RNA或DNA病毒的常规放行测试，灵敏度高，可检测潜伏或失活病毒。

4.三重检测流程

  4.1 预处理与初筛

  FBS解冻后依序通过0.2μm与0.1μm终端过滤，去除大部分细菌与真菌，将样品分装支专用无菌容器，置于-20℃隔离待测。

  4.2 无菌性检测

  同时实施有氧和厌氧培养，14d无菌或BacT/ALERT系统7d无菌结果合格。

  4.3 支原体检测

  21d培养结合Hoechst染色判断，16S rRNA广谱PCR为阴性。

  4.4 病毒检测

  接种于敏感细胞系，连续21 d观察CPE并做免疫染色确认。ELISA或RT-PCR需覆盖BVDV、BOIV、BoHV等常见病原并筛查区域性高风险病毒。

三、总结

  对胎牛血清进行细菌、病毒及支原体的“三无检测”是细胞培养科研与生物制剂生产的安全基石。从样品预处理到无菌、支原体及病毒检测，再到出具合规COA，各环节菌需严格执行国家法规和标准操作流程。

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有细菌、支原体培养相关培养基，可供广大新老客户参考、采购和使用

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