产气荚膜梭菌的活化、保存及鉴定

一、产气荚膜梭菌简介

  产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）也叫魏氏梭菌，革兰氏阳性杆菌，厌氧生长，但不严格厌氧，对少量氧气具有一定的耐受性，有荚膜，无动力，对人和动物通常具有致病性，在血平板上能产生双溶血环，能在30℃-47℃快速生长，具有一定的耐热性。

二、产气荚膜梭菌的培养

  该菌为厌氧菌，接种及培养需在厌氧工作站和厌氧培养箱（或厌氧罐、厌氧袋等设备）。若在空气中进行操作，通常建议时间控制在15min以内，长时间接触氧气易导致菌种死亡。

  液体培养基常用硫乙醇酸盐流体或庖肉培养基，接种后在36±1℃培养18-24h即可，菌落生长旺盛时，通常可在培养基表面观察到大量气泡出现。也可使用GAM、梭菌增菌培养基、RCM、等厌氧菌培养基进行活化培养。

  注：硫乙醇酸盐流体培养基的培养物通常要在24h内使用，超过24h菌种易开始衰减死亡，庖肉培养基则存活时间更久一些。

  固体培养基可使用TSA、哥伦比亚琼脂、血平板等常规培养基，36±1℃厌氧培养24-48h，菌落直径可达2-5mm。平板使用前进行预除氧处理，则更易培养成功。也可使用RCM琼脂、GAM琼脂等厌氧菌培养基进行活化培养。

三、产气荚膜梭菌的分离与培养

  1.分离培养与计数：产气荚膜梭菌对环丝氨酸、庆大霉素、多粘菌素、新霉素等药物不敏感，常用添加庆大霉素的哥伦比亚琼脂或添加环丝氨酸的TSC培养基在36±1℃培养24或48h进行分离培养或计数。产气荚膜梭菌可以产硫化氢，因此在TSC上菌落呈黑色。产气荚膜梭菌生长时，通常可以闻到较浓的臭味。

  2.纯化培养：挑取TSC或哥伦比亚琼脂上的可疑菌落，接种至硫乙醇酸盐流体培养基中36±1℃培养18-24h，或划线至TSA/血平板36±1℃厌氧培养24-48h。

  3.保存：产气荚膜梭菌为严格厌氧菌，相比于其他细菌更容易死亡，可使用甘油法或脱脂牛奶在-70℃以下长期冷冻保存。

四、鉴定

  1.镜检：产气荚膜梭菌为革兰氏阳性杆菌，镜检时有时可见一端膨大（内含芽孢体）。

  2.触酶试验：绝大多数梭菌属触酶试验为阴性，产气荚膜梭菌也是阴性。

  3.暴烈发酵试验：产气荚膜梭菌特有的试验现象，在46±1℃水浴培养，发酵牛奶中的乳糖产生大量气体，同时凝固牛奶中的酪蛋白，大量气体带动凝固的酪蛋白上升，形成蜂窝状结构，但不出现变黑现象。

  4.其他生化确认：产气荚膜梭菌可液化明胶，发酵乳糖，卵磷脂酶为阳性，在卵黄琼脂平板上菌落周围产生晕圈，动力试验为阴性，硝酸盐还原试验为阳性。

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