植物组培试验中常见的污染源、污染原因及解决办法

引言：

  在植物组培试验中，污染是影响试验成功率的关键因素之一。一旦发生污染，不仅会使培养材料受损，导致试验失败，还会消耗大量的资源。所以，深入探究常见污染源、污染原因，并制定切实可行的解决办法，对于保障植物组培试验的有序开展意义重大。

一、常见污染源

1、微生物污染

  微生物污染在植物组培试验中极为普遍，主要包含细菌污染和真菌污染两种。

  当细菌污染发生后，培养材料周围会很快出现黏液状物质，这些物质通常呈现出淡黄色或乳白色。随着细菌的不断繁殖，培养基会逐渐变得浑浊，原本清澈的培养基失去透明度。而且，细菌在代谢过程中会产生一些有异味的物质，比如硫化氢等，让人能通过嗅觉察觉到污染的发生。常见的引起细菌污染的细菌有大肠杆菌、葡萄球菌等，它们可以通过空气、操作人员的手部、接种工具等多种途径进入培养体系。

  在培养基表面或者培养材料上，会形成各种颜色的霉斑，常见的有白色、黑色、绿色、黄色等。这些霉斑其实是真菌的菌落，随着时间的推移，真菌的菌丝会不断蔓延，逐渐覆盖整个培养基表面和培养材料。真菌的孢子可以在空气中大量存在，一旦落在适宜的环境中，就会迅速萌发并造成污染。像青霉菌、曲霉菌、根霉菌等都是常见的引起真菌污染的真菌。

2、外植体自身污染

  外植体自身携带的微生物是造成污染的另一个重要来源，其中内生菌污染尤为突出。内生菌是指生活在植物组织内部，与植物形成共生关系的微生物，它们在植物的生长发育过程中可能起到一定的作用，但在组培环境中却会带来麻烦。例如，一些木本植物的茎段中存在大量的内生细菌和真菌，这些内生菌隐藏在植物细胞间隙或细胞内，常规的消毒方法很难将其彻底清除。当外植体被接种到培养基上后，在温暖、湿润且营养丰富的环境中，内生菌会突破植物组织的限制，大量繁殖，进而导致污染。此外，外植体表面也会附着大量微生物，如土壤中的细菌、空气中的真菌孢子等，如果消毒不彻底，这些表面的微生物也会引发污染。

二、污染原因

1、微生物污染原因

  （1）培养基灭菌不彻底：培养基是植物组培中供给培养材料生长发育的营养物质，其成分丰富，容易滋生微生物。如灭菌过程出现问题，就会给污染留下隐患。比如，在高压蒸汽灭菌时，若灭菌时间不足，对于一些抵抗力较强的微生物芽孢，就无法将其杀灭。一般来说，常规的培养基灭菌需要在121℃、0.105 MPa的条件下维持20分钟-30分钟，如果灭菌时间缩短到15分钟以下，就可能有部分微生物存活。灭菌温度不够也是一个常见问题，有些灭菌设备由于老化或故障，无法达到规定的灭菌温度，导致微生物不能被彻底杀死。另外，培养基在灭菌前分装不当，如分装量过多，在灭菌过程中热量无法充分传递到培养基内部，也会造成灭菌不彻底。

  （2）操作环境不洁净：接种室和培养室的环境状况与污染发生密切相关。接种室是进行接种操作的场所，如果室内空气洁净度不够，含有大量的微生物，在接种时，这些微生物会随着空气流动落到培养基和培养材料上。例如，接种室如果长时间不进行清洁和消毒，地面、墙壁、天花板上会积累灰尘，其中就含有大量的微生物孢子和细菌。培养室的环境也很关键，若培养室通风不良，空气不流通，湿度较高，就会为微生物的繁殖提供适宜的条件。操作台上的污染也不容忽视，操作人员在操作过程中，可能会将灰尘、杂物带到操作台上，这些东西上的微生物会通过接触传递到培养基或培养材料上。

  （3）操作人员操作不当：操作人员的操作规范程度直接影响污染的发生概率。在接种前，操作人员如果没有做好个人消毒，手上的微生物就会污染接种工具和培养材料。比如，没有用肥皂认真洗手，或者洗手后没有用75%的酒精擦拭，手上的细菌就会残留。穿着的工作服、帽子、口罩如果没有定期清洗和消毒，上面会附着大量的微生物，在操作过程中这些微生物可能会掉落并造成污染。在接种过程中，操作不规范也会引发污染。如打开培养皿的时间过长，会使更多的空气中的微生物进入培养皿；接种工具在使用前没有经过彻底灭菌，或者在使用过程中被污染后没有及时重新灭菌，就会将微生物带入培养基。此外，操作人员在操作时说话、咳嗽等行为，也可能将口腔和呼吸道中的微生物传播到培养环境中。

2、外植体自身污染原因

  （1）外植体采集不当：外植体的采集环境和时间会影响其携带微生物的数量。如果采集外植体的植株生长在污染严重的地方，如靠近垃圾堆、污水沟的地方，植株表面会附着大量的微生物。阴雨天气采集外植体也是不合适的，此时外植体表面湿度大，微生物容易滋生和繁殖，附着量会大幅增加。另外，采集外植体时如果选择了有病虫害的植株，这些植株本身就携带大量的病原微生物，会增加污染的可能性。

  （2）外植体消毒不彻底：外植体消毒是去除表面和部分内部微生物的关键步骤，消毒不彻底会直接导致污染。消毒试剂的浓度不够是常见问题，比如使用的升汞溶液浓度低于0.1%，对于一些顽固的微生物就无法起到杀灭作用。消毒时间不足也会影响消毒效果，如对表面带菌较多的叶片外植体，消毒时间过短，无法将表面的微生物全部杀死。不同的外植体适合的消毒方法不同，如果采用的消毒方法不正确，也会导致消毒不彻底。例如，对于绒毛较多的叶片，常规的浸泡消毒难以让消毒试剂充分接触到叶片表面的微生物，从而留下污染隐患。

三、解决办法

  （1）确保培养基灭菌彻底：要严格按照灭菌要求操作，根据培养基的种类和数量确定合适的灭菌时间和温度。对于常规的固体培养基，在121℃、0.105 MPa的条件下灭菌25分钟-30分钟；对于液体培养基，可适当缩短灭菌时间，但也要保证灭菌效果。在灭菌前，要对灭菌设备进行全面检查，包括压力表、温度计、安全阀等，确保设备能正常运行。可以先进行空载灭菌试验，检查设备是否能达到规定的温度和压力。灭菌后，要对培养基进行无菌检验，随机抽取部分培养基，在培养条件下放置3天-5天，如果没有微生物生长，说明灭菌合格。同时，培养基的分装要合理，避免分装过多，保证灭菌时热量能够充分传递。

  （2）保持操作环境洁净：定期对接种室和培养室进行清洁和消毒。接种室每周至少进行一次彻底清洁，包括地面、墙壁、操作台的擦拭，并用紫外线灯照射消毒30分钟-60分钟。每月可采用甲醛熏蒸的方法进行一次深度消毒，将甲醛和高锰酸钾按一定比例混合后，关闭门窗熏蒸6小时-12小时。培养室要保持通风良好，可安装空气净化器，降低空气中的微生物数量。控制培养室的温度在23℃-27℃，相对湿度在60%-70%，创造不利于微生物繁殖的环境。操作台要在每次操作前用75%的酒精擦拭消毒，操作过程中要保持整洁，及时清理杂物。

  （3）规范操作人员操作：操作人员要树立严格的无菌操作意识。接种前，先用肥皂仔细洗手，搓揉时间不少于1分钟，然后用流动水冲洗干净，再用75%的酒精擦拭双手和前臂。穿戴的工作服、帽子、口罩要定期清洗和灭菌，每次操作时都要更换干净的衣物。在接种过程中，要尽量缩短培养皿的打开时间，将培养皿的开口控制在最小范围内。接种工具要在高温灭菌器中灭菌，灭菌温度达到160℃-180℃，灭菌时间不少于30分钟。使用时，要避免接种工具接触到非无菌区域，每接种一个外植体后，都要对工具进行重新灭菌。此外，操作人员在操作过程中要避免说话、咳嗽，必要时要转头避开培养材料。

  （4）合理采集外植体：选择生长环境良好、无病虫害的植株作为外植体来源，优先选择生长在通风、光照充足、土壤洁净环境中的植株。采集时间要选择在晴天的上午，此时外植体表面的露水已经蒸发，湿度较低，微生物数量相对较少。采集时，要用经过灭菌的剪刀、镊子等工具，避免工具携带的微生物污染外植体。采集后的外植体要及时进行处理，避免长时间暴露在空气中。

  （5）优化外植体消毒方法：根据不同外植体的特点选择合适的消毒方式。对于叶片外植体，若表面光滑，可先用清水冲洗干净，再用75%的酒精浸泡15秒-30秒，然后用0.1%的升汞溶液浸泡8分钟-10分钟，最后用无菌水冲洗4次-5次；对于表面有绒毛的叶片，可在冲洗时用软毛刷轻轻刷洗，去除表面的杂质和部分微生物，再进行消毒。对于茎段外植体，先将其切成适当长度，去除叶片和多余的部分，用清水冲洗后，用75%的酒精浸泡30秒，再用0.1%的升汞溶液浸泡10分钟-15分钟，无菌水冲洗5次-6次。对于根段外植体，由于其生长在土壤中，带菌量较大，可先在流水下冲洗30分钟以上，再用10%的次氯酸钠溶液浸泡20分钟-30分钟，然后用无菌水冲洗多次。对于内生菌较多的外植体，可采用多次消毒的方法，或者在培养基中添加少量的抗生素，但要注意抗生素的种类和浓度，避免对培养材料造成伤害。

四、总结

  植物组培试验中的污染防控是一项系统工程，需要从污染源识别、污染原因分析到解决办法实施的各个环节都严格把控。只有将每个环节的工作都做到位，才能有效降低污染发生率，提高植物组培试验的成功率。在实际操作中，操作人员要不断总结经验，根据不同的植物种类和试验条件，灵活调整防控措施，以应对各种可能出现的污染问题。

五、植物组培相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有各种植物组培相关培养基，可供广大新老客户参考、采购和使用。

表1 海博生物植物培养基种类及货号

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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