近岸河流水域微生物检测-粪链球菌测定多管发酵法

引言

  微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水中常含有一定数量的病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中较为常见且具有重要影响的包括：沙门氏菌属、志贺氏菌属、粪链球菌、肠道病原性大肠埃希氏菌以及肠道病毒等。前文已简述沙门氏菌属的测定方法，本文将继续以《水和废水监测分析方法（第四版）》为参考依据，系统阐述粪链球菌的测定方法与流程，旨在为实际监测工作提供参考。

  对于其他近岸河流水域的相关内容可参考《近岸河流水域微生物取样方法及注意事项》、《近岸河流水域微生物采样点位的布置方法及注意事项》、《近岸河流水域微生物检测-水样的保存与运输》等文章。

一、粪链球菌介绍

  粪链球菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的短链状球菌，在链球菌血清学分族中主要属于兰斯菲尔德（Lancefield）D族，因此它曾与兰斯菲尔德D族链球菌被当作同义词。

1.粪便污染的指示菌

  粪链球菌进入水体后不再繁殖，可作为粪便污染的指示菌。人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物粪便中则相反，所以可通过两者菌数的比值（FC/FS）推测污染来源。《水和废水监测分析方法（第四版）》中以表1展示了不同动物FC/FS的相关数据。

表1粪大肠菌群与粪链球菌的菌数比值

  当比值≥4，污染主要来自人类；比值<4且>2，为混合污染但以人粪为主；比值<1且>0.7，为混合污染但以动物粪便为主；比值≤0.7，污染主要来自温血动物粪便；比值≤2且≥1，为混合污染但难以判定污染来源。

2.为尽量减小对比值错误的解释，要注意以下几点：

  测量水样pH值，因pH>9.0或<4.0时，链球菌密度会急剧改变；尽量靠近污染源采集水样，因为粪链球菌离开动物寄主后存活时间不长；当各种污染源都存在时，比值法判定可能不可靠，需调查污染确切来源；粪链球菌计数低于100CFU/100 mL时，不使用比值法。

二、粪链球菌的测定

  粪链球菌非测定主要有三种方法，分别为多管发酵法、滤膜法以及倾注平板培养法。本篇主要介绍第一种方法多管发酵法。

多管发酵法介绍：

  水中粪链球菌密度可采用MPN法估计。该方法虽手续繁杂，但适用于较混浊、含有害化学物质（尤其是金属物质）或杂菌过多的水样，不适用于海水样品。

  此法的步骤为：将水样接种于叠氮钠葡萄糖肉汤，叠氮化钠能抑制一般革兰氏阴性细菌生长，在此培养液中生长即为粪链球菌推测试验阳性。从推测试验阳性管中，用接种环取三环接种到乙基紫叠氮钠肉汤培养液，若能生长浑浊，则粪链球菌证实试验为阳性。

1.培养基

  (1)叠氮钠葡萄糖肉汤HB0266叠氮钠葡萄糖肉汤

  (2)乙基紫叠氮钠肉汤HB0267乙基紫叠氮钠肉汤

2.步骤

  (1)推测试验

  ① 将水样充分混匀，根据污染程度，接种三个不同量水样（如10mL、1mL、0.1mL或 1mL、0.1mL、0.01mL等）于叠氮钠葡萄糖肉汤（10mL水样接种于普通浓度培养液），每个量接种五管，共15管。

  ② 混匀后置于37℃恒温箱培养24h。

  ③ 如培养管内无明显浑浊，则延长培养24h。

  ④ 培养24h或48h后，叠氮钠葡萄糖肉汤中出现浑浊有细菌生长，即推测试验阳性，需进一步做证实试验。如图1。

图1 粪链球菌在叠氮钠葡萄糖肉汤的阳性结果

  (2)证实试验

  ① 用接种环（内径3mm）从推测试验阳性管中取一环接种至乙基紫叠氮钠肉汤（阳性管继续保留在37℃恒温箱）。

  ② 置于37℃培养箱中培养24h。

  ③ 若管底部出现紫色沉淀小圆块，或培养液有明显混浊生长，证实试验为阳性，即存在粪链球菌（出现菌膜或絮状生长不算阳性）。

  ④ 若24h培养后无生长，从恒温箱中原推测试验阳性管再取三环接种至原培养液，继续培养24h，如管底出现紫色沉淀小圆块或明显混浊生长，证实试验也为阳性。如图2。

图2 粪链球菌在乙基紫叠氮钠肉汤的阳性结果

3.计数及报告结果

  根据证实试验阳性管数，查MPN表，得出100mL水样中粪链球菌数，乘以10即为1000mL水样中的粪链球菌数。

三、相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有适用于水中粪链球菌检验的相关培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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