近岸河流水域微生物检测-粪链球菌测定滤膜法与倾注平板培养法

引言

  微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水中常含有一定数量的病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中较为常见且具有重要影响的包括：沙门氏菌属、志贺氏菌属、粪链球菌、肠道病原性大肠埃希氏菌以及肠道病毒等。

  前篇已简述粪链球菌的概念及多管发酵法的内容，本文将继续介绍另外两种测定粪链球菌的方法。

  对于其他近岸河流水域的相关内容可参考《近岸河流水域微生物取样方法及注意事项》、《近岸河流水域微生物采样点位的布置方法及注意事项》、《近岸河流水域微生物检测-水样的保存与运输》等文章。

一、粪链球菌的测定-滤膜法

  滤膜法所使用的KF链球菌培养基含有叠氮化钠，能抑制革兰氏阴性细菌生长；其中的2,3,5-三苯基四唑化氯（TTC）可进入链球菌菌体并被还原为红色，使滤膜上的粪链球菌菌落呈现红色或粉红色。通过计数这类菌落可推算水中粪链球菌数量，理想状态是每片滤膜上生长20CFU-100CFU粪链球菌菌落。必要时，可选取部分菌落进行证实试验，粪链球菌的过氧化氢酶试验为阴性，能在44.5℃环境中生长，且可水解七叶苷。该方法尤其适合检测含菌量少的水样。

1.培养基

  (1)KF链球菌琼脂培养基HB0268-4KF链球菌琼脂培养基

  (2)胆汁-七叶苷-叠氮化物琼脂培养基HB0133-5胆汁七叶苷叠氮钠琼脂

2.步骤

  (1)推测试验

  ① 水样过滤：根据水样中粪链球菌的预测密度选择水样量。若密度未知，需先按特定体积过滤，以确定适合计数的体积，再取该体积的1/10和10倍分别过滤。理想情况是一片滤膜上生长20CFU-60CFU粪链球菌菌落，且总菌落数不超过200CFU。《水和废水监测分析方法（第四版）》中以表1的形式展示了接种用水量的参考情况。

表1接种用水量参考表

  ② 过滤后，将滤膜放在KF链球菌琼脂培养基平板上，确保滤膜与平板间无气泡，倒置平板后，在37℃恒温箱中培养48h。

  ③ 粪链球菌菌落在滤膜上表现为大小不等的红色或粉红色菌落，通常为1mm-2mm，其大小会随细菌数量和培养时间变化。

  (2)证实试验

  将推测为阳性的菌落转接到胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板上，在44℃±0.5℃条件下培养48h。若菌落内或周围呈现褐色至黑色，则为粪链球菌。如图1。

图1 粪链球菌在胆汁七叶苷叠氮钠琼脂的结果

  若对确证培养基上的菌落有怀疑，可进行过氧化氢酶试验：向典型菌落上滴一滴过氧化氢溶液，粪链球菌的过氧化氢酶试验为阴性，不产生氧气泡的为粪链球菌。

3.计数及报告结果

  可用菌落计数器或放大镜计数滤膜上生长的粪链球菌菌落（其他菌落不计数），求出每1000mL水样中的粪链球菌数。

二、粪链球菌的测定-倾注平板培养法

  当水样过于混浊，或为经氯消毒处理的污水样，不适合用滤膜法检验时，可采用倾注平板培养法，计数生长在培养基内部或表面的典型菌落。但该方法不适用于粪链球菌数过少的水样。

1.培养基

  KF链球菌琼脂培养基HB0268-4KF链球菌琼脂培养基

2.步骤

  (1)测定方法与测定水中细菌总数基本一致。将水样充分混匀，根据污染情况，用灭菌吸管吸取原水样或不同稀释度的水样1mL，置于已灭菌的平皿底部（需做平行样品）。

  (2)把已灭菌融化且冷却至47℃左右的KF链球菌琼脂培养基约15mL倒入平皿底部，转动平皿使培养基与水样混合均匀，平放待其凝固。

  (3)待凝固后，在上层覆盖约5mL培养基，冷却凝固后，将平皿倒置，放在37℃恒温箱中培养48h。

3.用菌落计数器或低倍双目解剖显微镜（放大10-15倍）观察并计数培养基内部大小不等的红色或粉红色菌落（不计数其他色泽的菌落），以此计算每1000mL水样中的粪链球菌数。

三、相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有适用于水中粪链球菌检验的相关培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

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