CRISPR/Cas9系统的原理及应用

  在生命科学领域，基因编辑技术的发展为我们深入理解基因功能以及治疗各种疾病带来了前所未有的机遇。其中，CRISPR/Cas系统作为一种革命性的基因编辑工具，自被发现以来就备受瞩目。它以其独特的作用原理和广泛的应用前景，迅速成为了生命科学研究的焦点。

一、CRISPR/Cas系统的发现与分类

1.发现历程

  CRISPR/Cas系统最初是在细菌和古菌中被发现的，它是原核生物抵御噬菌体等外源核酸入侵的一种适应性免疫系统。科学家们在对细菌基因组进行研究时，发现了一些规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR），以及与之相关的Cas蛋白基因。经过深入研究，逐渐揭示了CRISPR/Cas系统在细菌免疫防御中的重要作用，并将其开发成为一种强大的基因编辑工具。

2.分类

  根据Cas蛋白的组成和功能，CRISPR/Cas系统可分为两大类：第1类系统需要多个Cas蛋白形成复合物来发挥作用；第2类系统则只需单个Cas蛋白即可完成功能。其中，CRISPR/Cas9属于第2类系统中的II型，而CRISPR/Cas13d属于第2类系统中的VI型。不同类型的CRISPR/Cas系统在作用机制和应用方面各有特点，为科研人员提供了多样化的基因编辑选择。

二、CRISPR/Cas9的作用原理

1.系统组成

  CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和向导RNA（guide RNA，gRNA）组成。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，具有两个核酸酶结构域（HNH和RuvC），能够切割DNA双链。gRNA则包含一段与靶DNA互补的序列，以及与Cas9蛋白结合的部分，它负责引导Cas9蛋白识别并结合到特定的DNA靶点上。

2.作用过程

  （1）gRNA设计与合成：科研人员根据目标基因的序列，设计并合成相应的gRNA。gRNA的靶向序列需要与目标DNA上的特定区域互补配对，且该区域附近必须存在PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，对于常用的化脓性链球菌来源的Cas9（SpCas9），其识别的PAM序列为5'-NGG-3'（N为任意核苷酸）。

  （2）复合物形成：合成的gRNA与Cas9蛋白结合，形成Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物（RNP）。在这个复合物中，gRNA的靶向序列呈单链状态，用于与靶DNA进行碱基互补配对。

  （3）靶标识别与结合：Cas9-gRNA复合物在细胞内搜索目标DNA序列，当gRNA的靶向序列与靶DNA上的互补序列匹配时，复合物就会结合到该位点。同时，Cas9蛋白会识别PAM序列，只有当PAM序列存在且正确时，Cas9蛋白才会被激活，进入切割状态。

  （4）DNA切割：一旦Cas9蛋白被激活，其HNH结构域会切割与gRNA互补的DNA链，而RuvC结构域则切割非互补链，从而在靶DNA上产生双链断裂（Double Strand Break，DSB）。

  （5）DNA修复与编辑：细胞内存在两种主要的DNA修复机制来应对DSB：非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）和同源定向修复（Homology-Directed Repair，HDR）。NHEJ是一种易错修复机制，它会直接将断裂的DNA末端连接起来，在连接过程中往往会引入碱基的插入或缺失突变，从而导致基因功能的丧失，可用于基因敲除。而HDR则需要一段与断裂位点两侧序列同源的供体DNA作为模板，在模板的指导下进行精确修复。如果在细胞中同时引入含有特定突变或外源基因的供体DNA，HDR机制就可以将供体DNA上的序列整合到断裂位点，实现基因的精确编辑，如基因敲入或碱基替换。

三、CRISPR/Cas9的应用

1.基因功能研究

  （1）基因敲除：通过设计针对目标基因编码区的gRNA，利用CRISPR/Cas9系统在该区域产生DSB，随后细胞通过NHEJ机制进行修复，引入随机的插入或缺失突变，导致基因移码突变，从而使基因功能丧失。这种方法可以在各种细胞系和模式生物（如小鼠、斑马鱼、果蝇等）中构建基因敲除模型，用于研究基因在发育、生理和病理过程中的功能。例如，在小鼠模型中敲除特定基因，观察其对生长发育、行为学以及疾病易感性等方面的影响，有助于深入了解该基因的生物学功能。

  （2）基因敲入：利用HDR机制，将外源基因或带有特定突变的DNA片段精准地插入到基因组的特定位置。这对于研究基因的功能域、构建疾病模型以及开发基因治疗策略具有重要意义。比如，在细胞系中敲入荧光标记基因，使其与目标基因融合表达，通过观察荧光信号可以直观地研究目标基因在细胞内的定位、表达水平以及蛋白质的动态变化。

  （3）基因激活与抑制：通过对Cas9蛋白进行改造，使其失去核酸酶活性，得到dCas9（dead Cas9）。将dCas9与转录激活结构域（如VP64）或转录抑制结构域（如KRAB）融合，当dCas9在gRNA的引导下结合到目标基因的启动子区域时，融合的激活结构域可以促进基因转录，实现基因激活（CRISPR activation，CRISPRa）；而融合的抑制结构域则可以抑制基因转录，实现基因沉默（CRISPR interference，CRISPRi）。这种方法可以在不改变基因序列的情况下，调控基因的表达水平，研究基因表达变化对细胞功能和表型的影响。

2.疾病治疗

  （1）单基因遗传病治疗：许多单基因遗传病是由于基因突变导致基因功能异常引起的。CRISPR/Cas9技术有望通过纠正致病基因突变，恢复基因的正常功能，从而达到治疗疾病的目的。例如，镰状细胞贫血是一种由于β-珠蛋白基因突变导致的遗传性血液病，研究人员尝试利用CRISPR/Cas9技术对患者的造血干细胞进行基因编辑，纠正突变基因，然后将编辑后的干细胞回输到患者体内，以产生正常的红细胞，为治疗镰状细胞贫血带来了新的希望。

  （2）癌症治疗：在癌症治疗方面，CRISPR/Cas9技术具有多种潜在应用。一方面，可以通过敲除肿瘤相关基因，如致癌基因或肿瘤耐药基因，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，增强肿瘤细胞对化疗、放疗等传统治疗手段的敏感性。另一方面，利用CRISPR/Cas9技术对免疫细胞（如T细胞）进行基因编辑，使其能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，发展出新一代的免疫治疗方法，如CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-cell）技术。通过CRISPR/Cas9技术精确编辑T细胞的基因，使其表达能够识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），经过体外扩增后回输到患者体内，增强机体对肿瘤细胞的免疫攻击能力。

  （3）传染病治疗：针对一些由病毒感染引起的传染病，CRISPR/Cas9技术也显示出潜在的治疗价值。例如，HIV病毒整合到人体细胞基因组中，难以被彻底清除。研究人员设想利用CRISPR/Cas9技术切割HIV病毒的基因组或其整合位点附近的宿主基因组序列，破坏病毒的复制和生存能力，从而为HIV感染的治疗提供新途径。此外，对于其他病毒感染性疾病，如乙肝、疱疹病毒感染等，CRISPR/Cas9技术也可用于开发抗病毒策略。

3.作物育种

  （1）改良作物性状：在农业领域，CRISPR/Cas9技术为作物育种提供了高效、精准的手段。通过编辑作物的相关基因，可以改良作物的多种性状，如提高作物的产量、增强对病虫害的抗性、改善作物的品质和营养价值等。例如，通过编辑水稻的基因，增强其对稻瘟病、白叶枯病等病害的抗性，减少农药的使用，保障粮食安全；或者通过编辑控制作物果实大小、形状、口感等品质相关基因，培育出更受消费者喜爱的农产品。

  （2）加速育种进程：传统的作物育种方法往往需要耗费大量的时间和精力，通过杂交和筛选来获得具有优良性状的品种。而CRISPR/Cas9技术可以直接对目标基因进行编辑，快速获得所需的遗传变异，大大缩短了育种周期。同时，该技术还可以精确地引入或修饰特定基因，避免了传统育种方法中可能带来的连锁累赘问题，提高了育种效率和精准度。例如，在小麦育种中，利用CRISPR/Cas9技术对控制株高、分蘖数、穗粒数等重要农艺性状的基因进行编辑，快速培育出高产、优质、抗逆性强的小麦新品种。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

上一篇：微生物在生活中的应用

下一篇：没有了！