GB4789.40-2024克罗诺杆菌的检验及鉴定方法

  在2024年，国家发布并实施了《GB4789.40-2024 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验》标准，相比较于2016版本的方法，改动内容也相对较多。

一、克罗诺杆菌的前增菌和选择性增菌培养

  前增菌培养采用900mL的BPW加入100g样品在36±1℃培养18±2h，这一步的主要目的是使样品中的克罗诺杆菌复苏、修复损伤并进行一定量的繁殖，有利于后续检出。由于使用的BPW体积较大，在培养箱内升温较慢，因此BPW在使用前需先预热至41±1℃，充分溶解样品以后，再进行培养。

  选择性增菌培养使用mLST-Vm培养基在41.5±1℃培养24±2h，培养基中含有的万古霉素、月桂基硫酸钠对革兰氏阳性菌具有较强的抑制效果，克罗诺杆菌具有一定的耐热性，在41.5℃培养条件下也可快速生长，同时减少不耐热杂菌的生长。

三、克罗诺杆菌的分离及纯化

  克罗杆菌的分离培养使用显色培养基，克罗诺杆菌可特异性分解培养基中的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙底物，使菌落呈现出蓝绿色。挑取mLST-Vm培养物划线接种至克罗诺杆菌显色培养基36±1℃培养24±2h后，挑取平板上的蓝绿色菌落（至少选5个，低于5个全选）划线接种至TSA平板上进行纯化，36±1℃培养24±2h，克罗诺杆菌通常为圆润光滑的扁平菌落，有时可见产黄色色素。

四、克罗诺杆菌的鉴定

  1、PCR鉴定（选做）：对于TSA平板上纯化的可疑菌落，可初步进行PCR鉴定。若PCR试验为阳性，则挑取该平板上的菌落继续进行生化鉴定，若PCR试验为阴性，则无需进一步鉴定。

  2、生化鉴定：对于PCR鉴定阳性或未经PCR鉴定的平板进行生化鉴定，克罗诺杆菌氧化酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，柠檬酸水解为阳性，不发酵山梨醇，发酵鼠李糖、蔗糖和蜜二糖，符合上述反应者为克罗诺杆菌。若有个别生化不符合，通常需结合PCR测试结果或补充其他鉴定方法进行确认。

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