胰蛋白酶-EDTA溶液概述

胰蛋白酶（Trypsin）是一种来源于猪胰的丝氨酸蛋白酶，用于在细胞培养中水解细胞表面的粘附蛋白，使贴壁细胞脱落。胰蛋白酶主要特异性地切割带正电荷的氨基酸（赖氨酸、精氨酸）羧基侧的肽键。其催化中心包含典型的Ser195-His57-Asp102三联体：Ser195的羟基在His57的催化下作为亲核试剂攻击底物肽键的羰基，形成四面体过渡态后断裂肽键，随后水分子（经His57活化）水解酶-底物中间体，释放产物并再生酶的活性。胰蛋白酶的S1结合口袋中有带负电荷的Asp残基，因而优先识别结合带正电荷侧链的底物。下图示意了胰蛋白酶活性中心结构及其S1口袋（黄色为催化三联体，红色表示结合阳离子侧链的口袋）

图1 胰蛋白酶结构图（图片来源于网络）

胰蛋白酶在37℃、pH7.4-7.6时活性最佳。在细胞传代过程中，胰蛋白酶通常与EDTA联合使用：EDTA螯合Ca²⁺和Mg²⁺，破坏钙依赖性粘附分子（如钙粘蛋白）介导的细胞–细胞和细胞–基质粘附，使细胞更易被胰蛋白酶消化分离。这种协同作用使胰蛋白酶能够有效剥离贴壁细胞形成单细胞悬液。

一、主要成分

1.胰蛋白酶：主要活性成分，多为猪胰提取的丝氨酸蛋白酶。常用浓度范围约0.05%–0.25%（对应500 mg/L–2500 mg/L）。

2.EDTA（乙二胺四乙酸，通常为二钠盐）：作为螯合剂加入，一般终浓度约0.02%-0.05%（1 mM-4 mM）。EDTA可稳定形成与Ca²⁺/Mg²⁺的配合物，从而去除培养基中Ca²⁺、Mg²⁺，削弱离子依赖的细胞粘附。

3.缓冲液：通常采用无Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水（PBS）或汉克斯平衡盐液（HBSS），pH调节在7.2-7.6左右，以维持接近生理的pH值和渗透压。这类缓冲盐水含有Na⁺、K⁺、Cl^-等离子成分，可保持细胞稳定。缓冲液还可帮助胰蛋白酶维持活性pH，同时在加入血清或胰抑制剂之前冲洗细胞、稀释胰酶。

二、成分的化学机制

1.胰蛋白酶的作用机制

胰蛋白酶的S1位点含有负电荷的Asp残基，可结合带正电荷的赖氨酸或精氨酸侧链，因此优先在这些氨基酸的羧基侧水解肽键。在催化过程中，Ser195被His57去质子化后作为亲核试剂攻击底物的羰基碳，形成带负电荷的四面体中间体；该中间体崩解断裂肽键，生成酶-底物硫酰化结合物；随后，His57活化的水分子攻击该硫酰酶中间体，最终释放断裂后的肽段并再生自由酶。该反应机制属于丝氨酸蛋白酶家族典型的双取代反应过程。胰蛋白酶在37℃、pH 7-9之间活性最佳，如pH下降会显著降低其酶活性。

2.EDTA的作用机制

EDTA是一种六齿（Hexadentate）螯合剂，可强烈与Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子配位形成稳定复合物。在细胞培养中，这一作用可显著降低细胞外Ca²⁺/Mg²⁺浓度，使钙依赖性粘附分子（如钙粘素）无法正常结合。由于钙粘素等分子需要Ca²⁺稳定结构并介导细胞间粘附，EDTA螯合钙离子后破坏了细胞-细胞之间的连接，从而辅助胰蛋白酶分解细胞外基质和粘附蛋白。此外，去除Mg²⁺也可抑制某些镁依赖的酶活性，但对细胞脱离的主要影响为Ca²⁺螯合效应。

3.缓冲液的作用

缓冲液（如PBS）含有磷酸盐、Na⁺、K⁺、Cl^-，能有效抵抗pH变化，将体系稳定在生理范围（通常pH 7.2-7.4）。稳定的pH对胰蛋白酶活性至关重要（其最佳pH约7.4-8.0），同时缓冲液中适宜的离子强度和渗透压可保护细胞免受渗透胁迫。使用不含Ca²⁺/Mg²⁺的缓冲液（如CaMg-free PBS或HBSS）可以在洗涤和稀释细胞时避免重新引入钙镁离子，从而保持EDTA的螯合作用。

三、具体应用

1.贴壁细胞传代，将培养瓶内原培养基吸去，用预热的无Ca²⁺/Mg²⁺平衡盐溶液（PBS或HBSS）冲洗细胞，以去除残留血清和离子。然后加入适量37℃预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（一般0.25% trypsin+0.02% EDTA），轻轻摇晃使其均匀覆盖细胞层，室温或37℃下孵育2分钟-5分钟观察细胞形态。大部分细胞变圆并脱落成悬浮状时，立即加入含血清的完全培养基（或等摩尔的胰蛋白酶抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂）以终止消化。使用少量血清可中和胰酶活性，保护细胞表面蛋白。然后收集细胞悬液，适度吹打打散细胞团，用离心回收细胞后重新接种。操作要点是密切观察细胞脱落情况，避免胰酶过度消化（一般不超过5分钟-10分钟），以防止去除过多细胞表面蛋白并导致细胞损伤。

2.组织消化与原代细胞分离，处理胚胎组织、器官或固体组织时，可先将组织剪碎或剁碎，以增大表面积，然后加入胰蛋白酶（常配合EDTA，有时联用胶原酶或DNase增强效果）在37℃孵育消化，制备单细胞悬液。例如，获取神经元或胚胎纤维母细胞时，常用0.05%–0.25%胰蛋白酶-EDTA在温浴中轻轻震荡消化数分钟。消化结束后，加入血清完全培养基终止反应，并用细胞筛过滤残留的组织块。随后按照需要进行离心、洗涤、计数并接种培养。需要注意不同细胞类型对胰酶敏感性不同：对胰酶极敏感的细胞（如某些神经元、肝细胞）可降低胰酶浓度或缩短消化时间，防止过度损伤。

3.原代细胞培养：经胰酶处理获得的单细胞可用于建立原代细胞系或直接进行实验。常见如从胚胎心脏、肺、肝等组织获得心肌细胞、肺成纤维细胞或肝细胞株。在原代分离中，胰蛋白酶-EDTA是常用的消化工具之一。实验中应严格无菌操作，并根据细胞类型调整胰酶浓度和消化时间。通常用含Ca²⁺的培养基（含血清）来终止消化并辅助细胞粘附。获得细胞后，可使用已知浓度的血清或胰酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂）终止消化，以最大程度保留细胞活力。

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