胰蛋白酶溶液的生产工艺及测定标准

一、原料选择与来源

胰蛋白酶传统上来自动物胰腺：主要取自猪、牛或羊的胰腺组织。工业上常将新鲜胰腺冻存并粉碎提取蛋白质。近年随着生物技术发展，非动物源重组胰蛋白酶也逐渐普及，这类酶通过基因工程（在大肠杆菌或酵母中表达猪胰蛋白酶基因）生产，具有纯度高、无动物来源污染等优点。因此，原料可分为：动物源（猪/牛/羊胰腺）和重组表达（微生物发酵）两类。

二、提取与纯化方法

对于动物源胰蛋白酶，先将胰腺冷冻后粉碎成浆状，用酸性溶液（如0.25N H₂SO₄）在低温（4℃）条件下搅拌提取数小时，隔夜静置后进行固液分离。提取液中分级盐析：先用30%硫酸铵饱和度沉淀去除部分杂蛋白，再在上清液中补充至70%饱和度以沉淀胰蛋白酶原粗品。收集沉淀并用去离子水溶解后，调节pH至弱酸并恒温静置，使胰蛋白酶原凝集沉淀，再次盐析（70%饱和）收集胰蛋白酶粗品。随后将粗品溶于水，调pH至8.0，在4℃下加入少量高纯度胰蛋白酶酶解（激活胰酶原）48小时。酶解完成后，上样至层析柱进行纯化：如通过亲和层析（以胰蛋白酶抑制剂为配基的凝胶介质）一次纯化胰蛋白酶，再经超滤浓缩（截留量约10kDa）和0.22 μm无菌过滤。最后采用真空冷冻干燥得到高纯度冻干粉末。总之，工业化提取流程通常包括：胰腺粉碎→酸提取→板框过滤→分级盐析→酶原酶解→层析纯化→超滤浓缩→冻干。与传统的多次结晶结合透析方法相比（活性一般2000U/mg-2700U/mg），引入层析等现代技术可大幅提高纯度和收率。

三、溶液配制过程

胰蛋白酶溶液制备时，常用纯化水或缓冲盐水（如PBS、Hank’s溶液等）为溶剂。缓冲体系可选择HEPES、Tris、MES等生物缓冲剂，将溶液pH调节在中性或弱碱范围以保障酶活。为稳定酶活力，通常加入1 mM-5 mM CaCl₂，因为Ca²⁺对胰蛋白酶有保护和激活作用；同时可加入适量NaCl或MgCl₂调节离子强度。另外常用无机盐配合表面活性剂或糖类作为稳定剂，如糊精、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）等。胰酶工作浓度依据应用而定：细胞传代一般使用0.05%-0.5%（w/v）胰酶溶液，如0.25%胰蛋白酶+0.02–0.03% EDTA等；大型工业用时也可配制浓度较高的母液（如1：250即2.5%溶液）后稀释。整个配制过程需要严格控温（通常室温或冰上）并进行微生物过滤，确保无菌。

1.溶剂与缓冲：采用去离子水或生理盐水，加入HEPES/Tris/MES等缓冲剂，并用NaOH/KOH调pH至约6.5–8.0。

2.浓度与配比：根据用途配置不同浓度，细胞消化常用0.05%~0.25%胰酶+0.02%~0.1% EDTA溶液；也可配制冻干粉后溶解到50U/mL-60U/mL左右（药典注射液要求）。

3.添加剂：为防止自溶和失活，可加入CaCl₂（1mM-5mM），并加入NaCl/MgCl₂调节离子强度；常用稳定剂包括糊精、海藻糖或BSA等。

4.配制步骤：一般先取部分水溶解缓冲剂调pH，再加盐和稳定剂溶解，最后加入胰蛋白酶并定容过滤。

四、酶活调控及测定标准

胰蛋白酶活力以标准酶活单位（U）计量：常见定义之一为在1 cm光程、25°C、pH 7.6缓冲液中，以苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物，紫外波长253nm下吸光度每分钟增加0.001（ΔA_（253）/min = 0.001）视为1个BAEE酶活单位。另有利用Na-苄氧羰基-L-精氨酸甲酯（TAME）在30°C、pH 8.1条件下测定的定义。中国药典规定干燥品胰蛋白酶的比活力不得低于2500U/mg，注射用冻干粉的效价应在标示含量的90%–120%之间。酶活测定一般采用BAEE法或药典规定的胰酶活力测定法，须在严格恒温、定量底物条件下记录ΔA/min并计算活力。此外，为保证标准化生产，还要检测α-胰蛋白酶与β-胰蛋白酶的比例（药典要求α≤20%、β≥70%）、SDS-PAGE纯度、水分、酸度等物理指标。针对重组胰酶，还应控制内毒素（通常≤5EU/mg）、微生物限度（≤100CFU/mL）和宿主细胞蛋白/外源DNA残留。若用于细胞培养或药用，溶液应进行无菌过滤并验证无菌、低内毒；实验室用高纯胰酶则需标注活力和蛋白含量等。

五、稳定性处理

胰蛋白酶易发生自溶和失活，故工业及实验用胰酶溶液需采取稳定措施。常规做法是将溶液分装并在低温保存：实验室级胰酶一般-20℃冻存（避免反复冻融），也有稳定配方（如加入特殊稳定剂）可在2℃–8℃冰箱下保存。冻干粉末形式的胰酶更易长期保存，贮藏时需密闭、阴凉防潮。配制时添加Ca²⁺可保护酶活，并可加甘油（防冻融损伤）、糖类（海藻糖、蔗糖）或蛋白（BSA）等作为稳定剂。此外，溶液需进行无菌过滤（0.22μm），高端应用中可添加少量叠氮化钠等防腐剂，确保溶液在存储期间抑制微生物生长。实验使用的胰酶一般建议2℃–8℃保存并短期内使用，以维持活性。

六、质量控制与标准化流程

胰蛋白酶产品应遵循药典和行业标准进行质量控制：①活力与含量：必须测定蛋白质含量和酶活力，干粉比活力需≥药典规定，如国药典要求≥2500U/mg；注射剂型需符合标示效价90%–120%。②纯度与组成：通过SDS-PAGE或HPLC检测纯度（通常要求≥95%），并测定α/β-胰酶含量比例（α≤20%、β≥70%）。③杂质检测：测定内毒素、重金属、残留有机溶剂等；如为重组胰酶还检测宿主蛋白/外源DNA、菌落总数等生物安全指标。④外观与理化：干粉应为白色或类白色无菌冻干物，重溶时澄清无絮状物；测定pH、干燥失重、无菌等物理化学指标以符合药典要求。最终产品需在GMP环境下生产，并取得相应检验报告和批记录，确保各项指标符合《中国药典》、USP等标准。

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