中国药典2025版中菌悬液的制备与保存

  在中国药典中，无菌检查法、微生物限度检查、控制菌检查等部分在进行方法适用性及培养基质控时常用到各种菌株的菌悬液，不同菌株的生长特性、存活时间存在差异，菌悬液的制备方法和保存时间也不完全相同。

一、菌株的活化

  金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，在TSA、TSB、FTM等培养基中均可快速生长，培养温度为30-35℃，活化时通常使用TSA或TSB培养18-24h即可。

  大肠埃希氏菌：革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，在TSA、TSB、FTM等培养基中均可快速生长，培养温度为30-35℃，活化时通常使用TSA或TSB培养18-24h即可。

  枯草芽孢杆菌：革兰氏阳性芽孢杆菌，好氧型细菌，培养温度为30-35℃，活化时使用TSA或TSB培养18-24h均可，由于本身为好氧型细菌，在TSB中生长时会在培养基表层形成菌膜，下层生长较弱。若要培养芽孢，可选用TSA或营养琼脂培养5-7天。

  乙型副伤寒沙门菌：革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，在TSA、TSB、FTM等培养基中均可快速生长，培养温度为30-35℃，活化时通常使用TSA或TSB培养18-24h即可。

  铜绿假单胞菌：革兰氏阴性杆菌，好氧型细菌，培养温度为30-35℃，活化时使用TSA或TSB培养18-24h均可，由于本身为好氧型细菌，在TSB中生长时会在培养基表层形成菌膜，培养时必须有充足的氧气，氧气不足可能导致铜绿假单胞菌不生长或生长差、不产色素等现象。

  生孢梭菌：革兰氏阳性杆菌，严格厌氧菌，接触氧气容易死亡，可使用FTM在30-35℃培养18-24h，但生孢梭菌在FTM中存活时间较短，培养超过24h会逐渐死亡，也可使用梭菌增菌培养基在30-35℃培养24-48h。

  白色念珠菌：真菌酵母类，又叫白色假丝酵母，为真核生物，进行有氧呼吸，在缺氧环境下虽然也能生长，但比有氧环境生长要慢，通常使用沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖液体培养基在20-25℃培养2-3天。

  黑曲霉：真菌霉菌类，真核生物进行有氧呼吸，充足的氧气更有利于霉菌的快速生长。在沙氏葡萄糖液体和沙氏葡萄糖琼脂中均可快速生长。但由于在液体中生长会形成团块，且不利于收集孢子，因此通常使用沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂制成斜面或平板在20-25℃培养5-7天至产生丰富的孢子后使用，培养过程需保证充足的氧气，缺氧可能导致产孢子迟缓或不产孢子。

二、菌悬液的制备

  大肠埃希氏菌/金黄色葡萄球菌/枯草芽孢杆菌/铜绿假单胞菌/白色念珠菌/乙型副伤寒沙门菌：可使用0.9%氯化钠溶液、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液进行稀释。

  生孢梭菌：可使用0.9%氯化钠溶液、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液进行稀释。但由于接触空气易死亡，在0.9%氯化钠溶液及磷酸盐缓冲液中存活时间相对较短，在pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中存活时间相对较长。

  黑曲霉：需洗脱孢子进行稀释，可使用0.9%氯化钠溶液、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液进行冲洗，由于孢子本身是聚集的且容易漂浮，因此通常需在稀释液中加入0.05%的吐温80，有利于孢子的均匀分散。

三、菌悬液的保存

  大肠埃希氏菌/金黄色葡萄球菌/枯草芽孢杆菌/乙型副伤寒沙门菌/铜绿假单胞菌/白色念珠菌：若使用0.9%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液制成的菌悬液，室温保存通常不超过2h，在2-8℃保存通常不超过24h。若使用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液制成的菌悬液，建议应在2h内使用（由于pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中含有少量的蛋白胨可提供营养，长时间存放会因繁殖而导致菌数明显增加）。

  生孢梭菌：由于本身易死亡，建议制备好的菌悬液在15min内使用，时间过长会导致菌数明显减少。可使用孢子悬液代替菌悬液，生孢梭菌可产生芽孢，具有较强的抵抗力，存活时间长，可在2-8℃验证的效期内保存（制作孢子悬液相比较于新鲜菌液更复杂，需培养至产生较多芽孢后，在80℃水浴10min杀死菌体，再进行稀释使用）。

  黑曲霉：黑曲霉的孢子悬液相对较为稳定，可在2-8℃验证的效期内保存，保存期甚至可以长达数月。但需注意，长期保存的孢子悬液应使用含0.05%吐温80的0.9%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液制备（真菌类对低温的耐受性较强，若使用pH7.0氯化钠蛋白胨制备孢子悬液，即使是在2-8℃环境中黑曲霉也可能萌发菌丝生长）。

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