细胞培养的答疑

1.
Q：细胞培养中常见的污染类型有哪些？如何预防和判断？
A：
• 污染类型：
  1. 细菌污染：培养基短期内变浑浊，显微镜下可见大量移动颗粒。
  2. 真菌污染：培养基中出现絮状或丝状漂浮物，pH值无明显变化。
  3. 支原体污染：细胞生长缓慢、形态异常，需通过PCR或荧光染色检测。
  4. 交叉污染：不同细胞系混杂，需通过STR鉴定确认。
• 预防措施：
  1. 严格无菌操作（超净台紫外线消毒、穿戴实验服及手套）。
  2. 定期更换培养基，避免长时间开盖暴露。
  3. 使用含抗生素的培养基（如1%双抗），但需注意长期使用可能导致耐药性。
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2.
Q：细胞传代时消化时间如何控制？消化过度或不足有何表现？
A：
• 控制方法：
  1. 根据细胞类型调整胰酶浓度（如0.05%-0.25%）及作用时间（通常1-5分钟）。
  2. 显微镜下观察细胞间隙变大、变圆后立即终止消化（加入含血清培养基）。
• 异常表现：
  1. 消化不足：细胞成片脱落困难，反复吹打易损伤细胞。
  2. 消化过度：细胞完全脱落成单细胞，存活率下降，贴壁能力减弱。
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3.
Q：细胞冻存后复苏存活率低，可能是什么原因？如何改进？
A：
• 可能原因：
  1. 冻存液配制不当（推荐含10% DMSO和90%胎牛血清）。
  2. 冻存降温速率过快（应使用程序降温盒或分阶段冻存：4℃→-20℃→-80℃→液氮）。
  3. 复苏时操作缓慢，细胞反复经历冰晶损伤。
• 改进措施：
  1. 复苏时快速解冻（37℃水浴1-2分钟内完成）。
  2. 解冻后立即用预温培养基稀释，离心去除DMSO残留。
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4.
Q：如何判断细胞状态是否健康？
A：
• 观察指标：
  1. 形态：贴壁细胞应铺展均匀，边缘清晰（如HeLa细胞呈多边形）；悬浮细胞大小均一，无聚集。
  2. 增殖速度：正常细胞传代后24-48小时进入对数生长期。
  3. 培养基颜色：健康细胞代谢活跃，培养基颜色（如酚红指示剂）24小时内由红变黄。
  4. 污染检测：定期镜检及无菌测试。
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5.
Q：培养基中是否需要添加谷氨酰胺？存放时有何注意事项？
A：
• 作用与添加：
  谷氨酰胺是细胞能量代谢的重要底物，但稳定性差（4℃下仅保存3周）。建议：
  1. 配制完全培养基时现用现加（终浓度2-4 mM）。
  2. 使用稳定性替代物（如GlutaMAX）。
• 存放要求：
  1. 未添加谷氨酰胺的培养基可4℃保存1个月；添加后需分装冻存（-20℃），避免反复冻融。
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6.
Q：细胞培养中出现“黑胶虫”污染如何处理？
A：
• 判断特征：

  培养基中有黑色小点移动，但对细胞生长影响较小，可能为微生物或血清沉淀。
• 处理方案：
  1. 更换优质血清（部分“黑胶虫”与血清质量相关）。
  2. 使用0.22 μm滤膜过滤培养基。
  3. 彻底清洁培养箱及实验环境，避免交叉污染。

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