洋葱伯克霍尔德菌群的鉴定和结果判读

  洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepacia Complex，BCC）隶属于伯克霍尔德菌属（Burkholderia），由若干种表型近似但基因型存在差异的菌种组成，代表菌种为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）。BCC广泛分布在水、土壤等生态环境中，能够利用多种有机物作为其单一代谢能源，对营养需求较低。BCC通常能够耐受常见的抗生素、消毒剂、抑菌剂，在没有有效检测方法时，低数量的BCC污染制药行业水系统，无法被药典中目前使用的微生物限度检查方法有效检出，而一旦BCC经过积累形成生物膜，基于其上述特性，将难以被彻底清除，并最终被引入终产品。BCC作为条件致病菌，在人类健康、生态环境及工业领域均存在显著危害，其危害特点因菌种差异而有所不同，但整体具有复杂性和潜在严重性。

  2025年版《中国药典》新增《1109 洋葱伯克霍尔德菌群检查法》，首次将高风险的洋葱伯克霍尔德菌群（BCC）纳入专项检查，该方法针对药品及生产环境中洋葱伯克霍尔德菌群（BCC）的检测建立了标准化流程。该标准通过胰酪大豆胨液体培养基对供试品增菌培养，并采用洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基对培养物中的微生物进行进一步检测，若培养基上检出呈灰白、灰粉色或土黄（棕）色的菌落，且菌落周围培养基由黄色变橘红或玫红色，应进行分离、纯化，并采用适宜的鉴定试验，确证是否为洋葱伯克霍尔德菌群。

一、生化鉴定

1. 革兰氏染色镜检

  伯克霍尔德菌属为革兰阴性，直或微弯曲杆菌，单个或成对排列，如图1所示。

图1 革兰氏染色结果

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

2. 葡萄糖氧化/发酵试验

  挑取纯化后的菌落接种于2支葡萄糖氧化/发酵管，其中一支加灭菌液体石蜡封口，另一支不封口，于36℃±1℃培养24h-72h，二者均变黄为葡萄糖发酵型，未加石蜡管变黄而加石蜡管不变色为葡萄糖氧化型。洋葱伯克霍尔德菌群为葡萄糖氧化型，结果如图2所示。

图2 葡萄糖氧化/发酵试验结果

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

  注意事项：由于不同的伯克霍尔德菌葡萄糖氧化能力不同，氧化产酸的速度不同，因此该试验培养时间至少3天，且每天上午下午各观察一次，只要生化管出现变黄即为阳性，以免菌株利用培养基中的营养物质产碱使培养基变回原来的紫色，做出错误的判断，如图3和图4所示。

图3 新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006培养3天的试验结果（左侧为空白对照管）

图4 神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010培养3天的试验结果（左侧为空白对照管）

3. 蔗糖氧化试验

  挑取纯化后的菌落接种于蔗糖氧化管，于36℃±1℃培养24h-72h，变黄为蔗糖氧化阳性。洋葱伯克霍尔德菌群为蔗糖氧化型，结果如图5所示。

图5 蔗糖氧化试验结果（左侧为空白对照管）

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

  在检测该项目时，做了两次试验才得到明确的结果。第一次试验三株伯克霍尔菌均接种一支试验管，洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005和新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006在36℃培养1天生化管明显变黄，而神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010培养3天未变黄，便处理掉了，没有观察到阳性结果；第二次重复检验，接种三支试验管，36℃培养5天两支生化管明显变黄，一支生化管微弱变黄，因此在做该试验时，最好接种两支以上试验管，避免出现假阴性，同时适当延长培养时间，每天观察颜色变化。

图6 蔗糖氧化试验结果（左侧为空白对照管）

4. 枸橼酸盐利用试验

  挑取纯化菌落接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基，36℃±1℃培养24h，培养基变蓝色为阳性，绿色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应，如图7所示。

图7 枸橼酸盐利用试验结果（左侧为空白对照管）

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

5. 氧化酶试验

  用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓型氧化酶阳性（紫红色、紫色或深蓝色），反应时间约为2min~10min，如图8所示。

  注：实验中切勿使用镍/铬材料。

图8 氧化酶试验结果

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

6. 过氧化氢酶试验

  用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，观察气泡产生情况。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓产气，1s后缓慢出现气泡，如图9所示。

图9 过氧化氢酶试验结果

备注：A：洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23005；B：新洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B) 23006；C：神秘伯克霍尔德菌CMCC(B) 23010

二、分子生物学鉴定

  上述的试验结果表明，BCC无法通过传统的生理生化试验等表型特征进行鉴别区分，对于它们的分类学研究多基于基因水平，而BCC种间98%~100%的16S rRNA同源性为使得作为细菌分类鉴别“金标准”的16S rRNA序列分析方法在BCC的分类学研究上显得捉襟见肘。在BCC分类学的研究进程中，看家基因recA发挥了重要作用，recA基因编码蛋白参与DNA重组修复，在细菌基因组中普遍存在，高度保守，其序列分析多应用于遗传关系相近的物种。BCC种间recA基因的同源性则为94%~95%，而同一基因型内部的同源性则达到98%~99%，弥补了16S rRNA对于BCC种间区分度不足的缺陷。

  recA基因测序使用的引物为BCR1：TGA CCG CCG AGA AGA GCA A；BCR2：CTC TTC TTC GTC CAT CGC CTC。三株伯克霍尔德菌recA基因测序后Blast结果如下表所示。

表1 三株伯克霍尔德菌recA基因测序后Blast结果

三、产品展示

  我公司有多种洋葱伯克霍尔德菌群检测的培养基，客户可根据实际应用情况和用途进行选用。

表2 产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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