弧菌分离培养基介绍

一、弧菌简介

  弧菌属（Vibrio）为革兰氏阴性无芽孢杆菌，菌体呈直杆状或弧状，具有极生鞭毛运动结构，氧化酶阳性且代谢方式多为发酵型。该属成员广泛分布于淡水、海水及鱼类或人类肠道中，多数菌种对营养要求不高，可在含2%-3%氯化钠的培养基中生长。部分菌种如副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌具有致病性，可通过皮肤创伤接触或食用污染海鲜感染免疫力低下人群。

  副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力较弱。

  霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。

  创伤弧菌（Vibrio vulnificus）归属弧菌科弧菌属，为革兰氏阴性杆菌，也称海洋弧菌，与霍乱弧菌、副溶血弧菌并列为人类感染疾病之三大弧菌之一。最早由美国疾病控制与预防中心（CDC）于1964年分离出来，1979年Farmer将其命名为创伤弧菌。其形态学特征有较高的辨识度，镜下呈逗点状、直棒状或球粒状，有鞭毛。需氧和厌氧均能生长，具有嗜盐性，易存活于中等盐度的水体中，几乎不存在于高盐度水体中。创伤弧菌主要分布于温带、热带和亚热带地区的海洋和河口中，常寄生在贝壳类的海洋生物中。

  溶藻性弧菌（Vibrio alginolyticus）是弧菌科弧菌属的革兰氏阴性嗜盐性细菌，曾于《Bergey氏细菌学鉴定手册》第八版被归类为副溶血性弧菌的生物型，后独立成种。该菌广泛分布于海水环境，1973年被确认对人类具有致病性，可通过污染食物引发腹泻或创伤感染。该菌与河流弧菌、拟态弧菌等同属嗜盐性弧菌，多活跃于夏秋季节的沿海水域。感染途径包括摄入受污染的海产品或通过皮肤伤口接触海水，临床表现以急性胃肠炎为主，伴有腹痛、呕吐及水样便，重症者可能出现败血症或休克。

二、弧菌常用的分离培养基

1、TCBS琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、酵母浸粉在培养基中作为基础营养物质提供菌体生长所需的氮源、碳源及维生素等各种生长因子；较高浓度的氯化钠满足弧菌嗜盐生长的需要；蔗糖作为可发酵碳源；枸橼酸钠、高pH碱性环境及硫代硫酸钠的存在抑制肠道菌的生长，牛胆粉、牛胆酸钠主要抑制革兰氏阳性菌的生长，此外，硫代硫酸钠还提供硫源，在柠檬酸铁存在的条件下可以检测细菌产硫化氢；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰作为酸碱指示剂；琼脂起凝固的作用。在该平板上生长的细菌如果能利用蔗糖产酸， 则使得混合指示剂（溴麝香草酚兰和麝香草酚兰） 的颜色变成黄色。

（2）产品配制方法

  称取本品8.9 g，煮沸溶解于100 mL蒸馏水中，冷至50℃时，倾入无菌平皿，备用。注：无需高压灭菌。

（3）弧菌接种至TCBS琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为蓝绿色斗笠状菌落，H2S阴性；溶藻弧菌为黄色菌落，H2S阴性；霍乱弧菌为黄色菌落，H2S阴性。

图1 弧菌在TCBS琼脂平板上的菌落特征

2、庆大霉素琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉浸粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；蔗糖提供碳源；亚硫酸钠可刺激弧菌生长；枸橼酸钠、庆大霉素和亚碲酸钾及较高的pH，可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性杂菌；霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH 值可增强其生长；琼脂是培养基的凝固剂。

  添加剂：每瓶需配套添加1盒HB0123 1%亚碲酸钾溶液使用，每1000 mL庆大霉素琼脂添加0.5 mL HB0123。

（2）产品配制方法

  称取本品149.5 g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在庆大霉素琼脂平板上，36℃±1℃培养14 h-18 h，霍乱弧菌菌落扁平湿润，中心黑色，直径2 mm-3 mm；副溶血性弧菌菌落扁平湿润，中心黑色，直径小于1 mm。

图2 弧菌在庆大霉素琼脂平板上的菌落特征

3、氯化钠蔗糖琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉浸粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压，且较高浓度的氯化钠有利于弧菌的生长；蔗糖为可发酵糖类；溴麝香草酚蓝为酸碱指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品98 g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在氯化钠蔗糖琼脂平板上，37℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为蓝绿色菌落，表面湿润；溶藻弧菌为黄色菌落。

a：副溶血性弧菌，b：溶藻弧菌

图3 弧菌在氯化钠蔗糖琼脂平板上的菌落特征

4、嗜盐菌选择性琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨为微生物的生长提供氮源和碳源；较高含量的氯化钠可抑制不耐高渗的细菌的生长；结晶紫抑制革兰氏阳性菌生长；琼脂是培养基的凝固剂；较高的pH可抑制部分杂菌的生长。

（2）产品配制方法

  称取本品77.0 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在嗜盐菌选择性琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为无色菌落，较湿润；溶藻弧菌为无色菌落。

a：副溶血性弧菌ATCC 17802；b：溶藻弧菌ATCC 17749

图4 弧菌在嗜盐菌选择性琼脂平板上的菌落特征

5、氯化钠血琼脂基础

（1）检验原理

  蛋白胨、酵母浸粉在培养基中作为营养物质提供菌体细胞生长所需的氮源、碳源等；甘露醇作为可发酵的碳源，发酵甘露醇产酸使得指示剂结晶紫变为黄色；高浓度的氯化钠作为选择因子可抑制非弧菌的生长；磷酸氢二钠作为缓冲体系；结晶紫作为酸碱指示剂；琼脂作为凝固剂。

  添加剂：需配套添加无菌脱纤维兔血或人血使用。

（2）产品配制方法

  称取本品11.3 g，煮沸溶解于100 mL蒸馏水中，待冷至45℃时，加入无菌脱纤维兔血或人血5 mL-10 mL，混合均匀，倾入无菌平皿，无需高压灭菌。

（3）弧菌在氯化钠血琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，典型菌落特征为菌落周围有半透明β溶血环。

6、T1N1琼脂

（1）检验原理

  胰蛋白胨提供生长必须的碳氮源；较高含量的氯化钠抑制不耐高渗透压的细菌；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品40.0 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在T1N1琼脂平板上，37℃±1℃需氧培养18 h-24 h，弧菌生长良好。

图5 弧菌在T1N1琼脂平板上的菌落特征

7、碱性琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；较高的pH有利于抑制大肠菌群和其他杂菌的生长，有利于霍乱弧菌的生长。

（2）产品配制方法

  称取本品33 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在碱性琼脂平板上36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为无色透明菌落，霍乱弧菌为无色透明菌落，扁平湿润。

图6 弧菌在碱性琼脂平板上的菌落特征

8、碱性胆盐琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉浸粉提供氮源、维生素和矿物质；氯化钠维持均衡的渗透压；牛胆盐抑制革兰氏阳性菌的生长；偏碱性的环境有利于弧菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品47.0 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高温灭菌15 min，备用。

（3）弧菌在碱性胆盐琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为无色透明菌落，霍乱弧菌为无色透明菌落，扁平湿润。

图8 弧菌在甘碱性胆盐琼脂平板上的菌落特征

9、弧菌显色培养基（第二代）

（1）检验原理

  弧菌显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、海产品、病人粪便样品和水产品中副溶血性弧菌的快速检测。副溶血性弧菌显蓝绿色且菌落比较大，霍乱弧菌和创伤弧菌显紫红色，溶藻弧菌显淡黄色或米黄色；其它细菌绝大部分被抑制。

  本培养基的特异性高，可以克服TCBS培养基引起的假阴性结果，是一种很理想的快速检测培养基。利用弧菌自身代谢产生的酶与相应显色底物反应使菌落显色，以区分目标菌与非目标菌。显色底物是由产色因子和微生物部分可代谢物质组成，在特异性酶作用下，游离出产色因子使菌落显示一定颜色。

（2）产品配制方法

  称取本品18.9 g，加入200 mL蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸3-5次。冷却至45℃-50℃时，倾入无菌平皿。注意：制备好的培养基表面不能太干燥。

（3）弧菌在弧菌显色培养基（第二代）平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌显蓝绿色且菌落比较大，霍乱弧菌和创伤弧菌显紫红色，溶藻弧菌显淡黄色或米黄色。

图9 弧菌在弧菌显色培养基（第二代）平板上的菌落特征

11、MCPC培养基

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉浸粉作为培养基中的基础营养物质，提供细菌生长所需的碳氮源、维生素和其他的生长因子；氯化钠维持培养基体系的渗透压平衡；多粘菌素B和多粘菌素E能抑制副溶血性弧菌和溶藻弧菌等非目标菌的生长；纤维二糖为可发酵的糖类；溴百里酚兰和甲酚红为pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

  添加剂：每瓶需配套添加10盒HB4151a CPC培养基添加剂和10盒HB4151b 10%纤维二糖水溶液使用。

（2）产品配制方法

  称取本品50.0 g，加热煮沸溶解900 mL蒸馏水中，分装每瓶90 mL，冷却到48℃-55℃时，加入10%纤维二糖溶液10 mL和1支mCPC添加剂（多粘菌素E 40000 units和多粘菌素B 10000 units）混匀，倾入平皿，无需高压灭菌。

（3）弧菌在MCPC培养基平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，副溶血性弧菌为圆形扁平，中心不透明，边缘透明的黄色菌落，霍乱弧菌为紫色菌落。

图10 弧菌在MCPC培养基平板上的菌落特征

12、副溶血性弧菌琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；牛胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰是pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品100.28 g，加热煮沸溶解于1000 mL蒸馏水中，冷至45℃-50℃左右时，倾入无菌平皿。

（3）弧菌在副溶血性弧菌琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，溶藻弧菌、霍乱弧菌和河流弧菌为黄色菌落，创伤弧菌和副溶血性弧菌为绿色菌落。

图11 弧菌在副溶血性弧菌琼脂平板上的菌落特征

13、四号琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；亚硫酸钠可刺激弧菌生长；柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、牛胆粉、利凡诺、庆大霉素和亚碲酸钾及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性杂菌；霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长；琼脂是培养基的凝固剂。

  添加剂：每瓶需配套添加1盒HB0123 1%亚碲酸钾溶液使用。

（2）产品配制方法

  称取本品60.0 g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，冷至50℃-55℃时，每1000 mL培养基中加入无菌1%亚碲酸钾溶液1 mL，混匀，倾入无菌平皿，备用。注：无需高压灭菌。

（3）弧菌在四号琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养14 h-18 h，霍乱弧菌为菌落扁平湿润，中心黑色，直径2 mm-3 mm，副溶血性弧菌菌落小于1 mm。

图12 弧菌在四号琼脂平板上的菌落特征

14、纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；纤维二糖为可发酵的糖类；多粘菌素B和多粘菌素E能抑制副溶血性弧菌和溶藻弧菌等非目标菌的生长；溴麝香草酚蓝和甲酚红为pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

添加剂：每瓶需配套添加10盒HB4151-1a CC琼脂添加剂和10盒HB4151b 10%纤维二糖水溶液使用，每90 mL CC琼脂添加1支HB4151-1a和2支HB4151b。

（2）产品配制方法

  称取本品50.0 g，加热煮沸溶解于900 mL蒸馏水中，分装每瓶90 mL，冷却到48℃-55℃时，加入10%纤维二糖溶液10 mL和1支CC琼脂添加剂（多粘菌素E 40000 units）混匀，倾入无菌平皿，无需高压灭菌。

（3）弧菌在纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，创伤弧菌为圆形扁平，中心不透明，边缘透明的黄色菌落，霍乱弧菌为紫色菌落，副溶血性弧菌被抑制。

1.创伤弧菌ATCC27562   2.副溶血性弧菌ATCC17802   3.霍乱弧菌非01群

图13 弧菌在纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂平板上的菌落特征

15、CPC琼脂基础

（1）检验原理

  蛋白胨、䏡胨提供细菌生长的基本营养，稍高含量的氯化钠、氯化镁和氯化钾提供与海水相近的渗透压，有利于弧菌的生长，溴麝香草酚蓝和甲酚红为酸碱指示剂，酸性条件下均显黄色，溴麝香草酚蓝碱性条件下显蓝色，甲酚红碱性条件下显紫红色，纤维二糖为可发酵碳源，较高浓度的多粘菌素B和多粘菌素E可抑制大多数革兰氏阴性菌的生长。创伤弧菌可在此培养基中生长，分解纤维二糖产酸，菌落呈黄色，菌落周围因产酸也变为黄色。其他不能利用纤维二糖的弧菌，菌落通常呈蓝绿色至紫红色。

  添加剂：需配套HB4151b 10%纤维二糖水溶液和HB8852a CPC琼脂添加剂。

（2）产品配制方法

  称取本品45.95 g，加热煮沸溶解于900 mL蒸馏水中，分装，每瓶90 mL，冷却至48℃-55℃左右时，每90 mL培养基中加入无菌10%纤维二糖溶液15 mL和1支CPC琼脂添加剂（多粘菌素B 40000IU、多粘菌素E 100000IU），混匀，倾入无菌平皿，备用。

（3）弧菌在CPC琼脂平板上，36℃±1℃需氧培养18 h-24 h，创伤弧菌为黄色菌落，周围变黄，霍乱弧菌为蓝绿色至紫色菌落，周围变紫。

图14 弧菌在CPC琼脂平板上的菌落特征

三、产品展示

  我公司有多种弧菌检测的培养基，客户可根据实际应用情况和用途进行选用。

表1 部分产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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