细胞培养基所需要的常规添加剂

在细胞生物学研究与生物制药生产中，细胞培养基是维持细胞存活、增殖及功能表达的核心基础。除基础营养成分（如碳水化合物、氨基酸、维生素等）外，添加剂的合理选择与使用，直接决定了细胞培养体系的稳定性、细胞活性及实验结果的可靠性。本文将系统介绍血清、抗菌素、HEPES、谷氨酰胺、碳酸氢钠等关键添加剂的功能、特性及应用注意事项，为细胞培养实践提供参考。

一、血清：细胞生长的“天然营养库”

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的血清。血清是细胞培养基中应用最广泛的天然添加剂，主要来源于牛（胎牛、新生牛）、马或人，其中胎牛血清（FBS）因营养成分丰富、杂质含量低，成为多数哺乳动物细胞培养的首选。

1、血清中的成分和功能

血清中通常含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。

血清可提供生长因子与细胞因子：血清中含有表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素等多种活性物质，可激活细胞信号通路，促进细胞增殖与分化；同时包含白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子，调节细胞免疫应答与代谢状态。

血清可补充基础营养缺口：血清中含有白蛋白、转铁蛋白、脂蛋白等载体蛋白，可结合并运输培养基中的脂肪酸、维生素、矿物质（如铁离子），解决部分营养成分水溶性差或易沉淀的问题；此外，血清还含有人体必需氨基酸以外的特殊氨基酸及核苷酸前体，满足细胞高活性代谢需求。

血清可维持培养基稳定性：白蛋白具有缓冲能力，可缓解培养基pH值的剧烈波动；同时，血清中的蛋白酶抑制剂能抑制细胞分泌的蛋白酶对自身的损伤，保护细胞结构完整。

2、血清质量评估和对细胞的促生长效果

鉴于血清成分复杂，在使用前应对血清质量进行理化性质和微生物检测鉴定，理化性质包括渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35 g/L -45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。微生物检测包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径0.22 µm的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难以察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。

对于血清对细胞的促生长效果，可通过克隆形成率、贴瓶率或连续传代培养法测定，克隆形成率测定是以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到96孔板，每孔200 µL，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的区别。贴瓶率测定是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较，判断血清质量高低。连续传代培养法是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为5％浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。

此外，部分实验需对血清进行56℃、30分钟的热灭活处理，以去除补体系统（避免其对敏感细胞产生细胞毒性）和部分病毒，但灭活可能破坏血清中的部分生长因子，需根据细胞类型决定是否进行。

二、抗菌素：预防污染的“防护屏障”

细胞培养过程中易受细菌（如大肠杆菌、葡萄球菌）、真菌（如酵母菌、霉菌）污染，在培养基内常加入适量抗菌素，抗菌素可有效抑制或杀灭这些微生物，保障培养体系洁净。常用的抗菌素组合为青霉素-链霉素（Pen-Strep），部分培养基会搭配庆大霉素、两性霉素B等。

1、抑菌原理

青霉素：通过抑制细菌细胞壁的合成，对革兰氏阳性菌（如链球菌、葡萄球菌）具有强效杀灭作用，对部分革兰氏阴性菌（如淋球菌）也有抑制效果。

链霉素：作用于细菌核糖体30S亚基，干扰蛋白质合成，主要针对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、绿脓杆菌），对部分革兰氏阳性菌（如结核杆菌）同样有效。

两性霉素B：属于抗真菌药物，通过破坏真菌细胞膜的固醇结构，导致膜通透性增加，内容物泄漏，从而杀灭酵母菌、霉菌等真菌。

2、应用注意事项

使用浓度控制：常规青霉素-链霉素组合的工作浓度为青霉素100 U/mL和100 μg/mL的链霉素，浓度过高可能对细胞产生毒性（如抑制细胞增殖、诱导凋亡），需严格按照培养基体积比例添加。

避免长期依赖：抗菌素不能替代无菌操作，长期使用可能导致耐药菌株出现，或掩盖低水平污染（如支原体污染，常规抗菌素对其无效）。建议仅在细胞复苏、传代等污染风险较高的阶段短期使用，稳定培养阶段尽量不加。

针对性选择：若怀疑真菌污染，需额外添加两性霉素B（工作浓度通常为2.5 μg/mL）；若细胞对青霉素敏感，可替换为庆大霉素（工作浓度50 μg/mL）。

三、HEPES：维持pH稳定的“高效缓冲剂”

细胞培养需在严格的pH范围内（多数哺乳动物细胞适宜pH为7.2-7.4）进行，常规培养基中的碳酸氢钠缓冲系统依赖于CO₂环境（通常为5%的CO₂），但在CO₂浓度波动、细胞代谢产酸（如乳酸）增加或开放式培养（如换液过程）时，pH易偏离适宜范围。HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）是一种非碳酸盐氢离子缓冲剂，对细胞无毒性作用，可在pH为6.8-8.2的范围内提供稳定缓冲能力，弥补碳酸氢钠的不足。

1、缓冲机制

不依赖CO₂的缓冲作用：HEPES的缓冲机制不依赖CO₂/HCO₃⁻平衡，即使在CO₂浓度不稳定或无CO₂培养箱的场景下，仍能有效抵抗pH变化，尤其适合悬浮细胞培养或短期开放式操作（如细胞计数、染色）。

增强代谢耐受性：细胞代谢旺盛时会产生大量乳酸，导致培养基pH下降（酸化），HEPES可快速中和部分酸性物质，减缓pH下降速度，延长培养基使用时间，减少换液频率。

2、应用注意事项

工作浓度：常规添加浓度为10mmol/L-50 mmol/L，浓度过高（如超过50 mmol/L）可能对细胞产生渗透压应激，影响细胞形态与活性，需根据细胞耐受度调整。

成本考量：HEPES价格较高，完全替代碳酸氢钠不经济，实际应用中通常采用“HEPES+碳酸氢钠”混合缓冲系统（如添加25 mmol/L的HEPES+2.2 g/L碳酸氢钠），兼顾缓冲效果与成本。

四、谷氨酰胺：细胞代谢的“关键能量源”

谷氨酰胺是哺乳动物细胞必需的氨基酸之一，合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。虽属于基础培养基成分，但因其易分解的特性（在水溶液中易转化为氨和焦谷氨酸，氨对细胞有毒性），4℃下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，通常在培养基使用前单独添加。

1、主要功能

能量代谢核心底物：细胞可通过谷氨酰胺分解（谷氨酰胺酵解）产生ATP，为细胞增殖提供能量，尤其在葡萄糖代谢不足时，谷氨酰胺可作为主要能量来源（如肿瘤细胞、快速增殖的免疫细胞）。

合成代谢前体：谷氨酰胺的氨基可用于合成其他氨基酸（如丙氨酸、天冬氨酸）、核苷酸（DNA/RNA合成）及谷胱甘肽（抗氧化剂，保护细胞免受活性氧损伤），是细胞结构与功能物质合成的关键原料。

2、应用注意事项

现配现加：谷氨酰胺溶液（通常配制为200 mmol/L的储存液，-20℃冷冻保存）需在培养基使用前解冻并添加，避免长期室温放置导致分解。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1 mmol/L～4 mmol/L。

替代选择：若需延长培养基保质期，可使用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（一种稳定的谷氨酰胺二肽）替代，其在水溶液中稳定性高，可耐受反复冻融，且进入细胞后可被二肽酶分解为谷氨酰胺，功能与天然谷氨酰胺一致。

五、碳酸氢钠：CO₂环境下的“基础缓冲剂”

碳酸氢钠是绝大多数合成培养基（如DMEM、RPMI-1640）中的必备成分，其缓冲作用依赖于“碳酸氢钠-CO₂”平衡系统（HCO₃⁻+H⁺⇌H₂CO₃⇌CO₂+H²O），是维持细胞培养环境pH稳定的基础。

1、核心功能

平衡细胞代谢产酸：细胞代谢过程中产生的CO₂和乳酸会使培养基pH降低，碳酸氢钠可释放HCO₃⁻，与H⁺结合形成H₂CO₃，再分解为CO₂并被培养箱中的CO₂控制系统排出，从而维持pH稳定。

调节培养基渗透压：碳酸氢钠的添加量会影响培养基的渗透压（多数哺乳动物细胞适宜渗透压为280-320 mOsm/kg），其常规添加浓度为2.2g/L-3.7 g/L（对应5%的CO₂环境），可通过调整浓度适配不同CO₂浓度（如10% CO₂环境下可提高至5.6 g/L）。

2、应用注意事项

适配CO₂浓度：碳酸氢钠的缓冲效果与培养箱CO₂浓度直接相关，若CO₂浓度不足（如低于5%），HCO₃⁻会过度分解为CO₂流失，导致培养基pH升高（碱化）；若CO₂浓度过高（如高于10%），则会导致pH降低（酸化），需严格匹配两者比例。

避免沉淀：碳酸氢钠溶液与含钙离子的培养基混合时（如添加了钙盐的DMEM），若浓度过高或混合过快，可能形成碳酸钙沉淀，影响营养成分利用。建议在配制培养基时，先溶解其他成分，最后缓慢加入碳酸氢钠并充分搅拌。

六、总结

血清、抗菌素、HEPES、谷氨酰胺、碳酸氢钠等常规添加剂，分别从营养供给、污染防控、环境稳定、代谢支持等维度，共同构建了适宜细胞生长的“微环境”。在实际应用中，需根据细胞类型（如贴壁细胞或悬浮细胞、原代细胞或细胞系）、培养目的（如基础研究或大规模生产）及实验条件（如CO₂培养箱可用性、无菌等级），灵活调整添加剂的种类、浓度与使用方式，才能实现细胞的高效、稳定培养，为后续研究与生产提供可靠保障。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

上一篇：有动力的细菌及检测方法

下一篇：没有了！