大肠菌群分离培养基介绍

一、大肠菌群简介

  大肠菌群（Coliforms）并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》将其定义为：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

  大肠菌群主要包括肠杆菌科中埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢；在35℃-37℃条件下，48 h内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7d-30d后在环境中的变异。所以食品中检出大肠菌群就表示食品受人、温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。

二、大肠菌群常用的分离培养基

1、去氧胆酸盐琼脂（DC）（日本标准）

（1）检验原理

  蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可发酵的糖类；氯化钠可维持均衡的渗透压；柠檬酸铁、柠檬酸钠和去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌的生长；磷酸氢二钾为缓冲剂；琼脂是培养基的凝固剂；中性红为pH指示剂，发酵乳糖产酸的细菌菌落为红色，不发酵乳糖的细菌为无色。

（2）产品配制方法

  称取本品43.0g，加入1000mL蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌，煮沸1分钟。冷却至45℃-50℃左右时，倾入无菌平皿，无需高压灭菌。

（3）大肠菌群在去氧胆酸盐琼脂上，36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落为粉红色、紫红色或红色，菌落周围有或无胆盐沉淀环。

图1 大肠菌群在去氧胆酸盐琼脂平板上的菌落特征

2、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

（1）检验原理

  蛋白胨和酵母浸粉提供碳氮源、维生素、生长因子和辅酶等其他营养物质；氯化钠维持均衡的渗透；乳糖为可发酵碳水化合物，可作为一种能量来源；结晶紫对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其他革兰氏阴性菌和抗酸菌几乎无作用；中性红为指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品41.5g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，煮沸不要超过2分钟。取适宜稀释度样品液1mL，加入到无菌平皿中心，将冷至45℃-50℃的VRBA 10mL-15mL倾注于平皿中。小心旋转平皿将培养基与样液充分混匀。凝固后，再加3mL-4mL VRBA覆盖平板表层，待凝固后翻转平板，放置培养。无需高压灭菌。临用时制备，不得超过3h。

（3）大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落特征为紫红色菌落，可有胆盐沉淀环。

图2 大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）平板上的菌落特征

3、品红亚硫酸钠琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉提供碳氮源、维生素和矿物质；乳糖为可发酵的糖类；琼脂是培养基的凝固剂；磷酸氢二钾为缓冲剂；亚硫酸钠能将碱性品红还原，使其褪色。乳糖发酵的细菌产生乙醛，在存在碱性品红的情况下乙醛与亚硫酸钠结合形成红色菌落，快速发酵乳糖的细菌产生金属光泽，不发酵乳糖的细菌形成无色透明菌落。

（2）产品配制方法

  称取本品52.5g，加入20mL无水乙醇和980mL蒸馏水，加热搅拌溶解，分装，115℃高压灭菌20分钟，备用。

（3）大肠菌群在品红亚硫酸钠琼脂上，36℃±1℃培养24h±2h，典型菌落特征为紫红色菌落有或稍有金属光泽。

图3 大肠菌群在品红亚硫酸钠琼脂平板上的菌落特征

4、Endo培养基

（1）检验原理

  蛋白胨提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸二氢钾是缓冲剂；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；碱性品红为指示剂，具有醌式结构，呈深红色，亚硫酸钠能将碱性品红还原，使其褪色，所以制成的培养基呈淡粉红色；琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品39.0g，加入20mL无水乙醇和980mL蒸馏水，加热搅拌溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

（3）大肠菌群在Endo培养基上，36℃±1℃培养24h±2h，典型菌落特征为紫红色菌落有或稍有金属光泽。

图4 大肠菌群在Endo培养基平板上的菌落特征

5、茜素-β-半乳糖苷琼脂（Aliz-gal琼脂）

（1）检验原理

  胰酪胨提供氮源、维生素和矿物质满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂；月桂基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌；大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解培养基中的酶底物茜素-β-D-半乳糖苷（Aliz-gal），使茜素游离，并与培养基中的铝、钾、铁、铵离子结合形成紫色（或红色）的螯合物，使菌落呈现相应的颜色。

（2）产品配制方法

  称取本品46.7g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，116℃高压灭菌10分钟，备用。

（3）大肠菌群在茜素-β-半乳糖苷琼脂（Aliz-gal琼脂）上，36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落特征为紫红色菌落。

图5 大肠菌群在茜素-β-半乳糖苷琼脂（Aliz-gal琼脂）平板上的菌落特征

6、Tergitol-7琼脂

（1）检验原理

  胰酪蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；溴麝香草酚兰是酸碱指示剂，Tergitol-7是表面活性剂，琼脂是培养基的凝固剂。

（2）产品配制方法

  称取本品56.15g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右时，加入4mL过滤除菌的1% TTC溶液，混匀，倾入无菌平皿。

（3）大肠菌群在Tergitol-7琼脂上，36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落特征为红色菌落，黄色晕圈。

图6 大肠菌群在Tergitol-7琼脂平板上的菌落特征

注：a：大肠埃希氏菌，b：产气肠杆菌，c：阴沟肠杆菌

7、Les Endo琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨，䏡胨，酸水解酪蛋白提供氮源和碳源，维生素和矿物质；酵母浸粉提供B族维生素；乳糖作为可发酵糖类；氯化钠用于维持细胞渗透压；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾作为pH缓冲剂，去氧胆酸盐和十二烷基硫酸钠能够抑制革兰氏阳性细菌的生长；碱性品红为指示剂，亚硫酸钠能将碱性品红还原，使其褪色，发酵乳糖的细菌产生乙醛，与亚硫酸钠和碱性品红生成红色菌落。

（2）产品配制方法

  称取本品51.0g，另取20mL 95%的乙醇，加入980mL蒸馏水中搅拌加热溶解，分装，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃-50℃时，倾入无菌平皿中，备用。

（3）大肠菌群在Les Endo琼脂上36℃±1℃需氧培养24h±2h，典型菌落特征为紫红色菌落，有或无金属光泽。

图7 大肠菌群在Les Endo琼脂平板上的菌落特征

8、大肠菌群显色培养基（干粉）

（1）检验原理

  大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠菌群的快速检测。大肠菌群显蓝绿色，其它菌显黄色或无色，革兰氏阳性菌被抑制。

（2）产品配制方法

  称取本品47.9g，加入1000mL蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟。分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃-50℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在超净工作台中开盖吹15-30分钟，去掉培养基表面水汽，备用。

（3）大肠菌群在大肠菌群显色培养基上，36℃±1℃培养18h-24h，大肠菌群典型菌落为蓝绿色，其它细菌为无色或黄色菌落。

图8 大肠菌群在大肠菌群显色培养基平板上的菌落特征

9、大肠杆菌／大肠菌群显色培养基（第二代）（干粉）

（1）检验原理

  大肠杆菌/大肠菌群显色培养基（第二代）是青岛海博生物公司再次改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色，革兰氏阳性菌被抑制。

（2）产品配制方法

  称取本品46.3g，加入1000mL蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟。冷却至45℃-50℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在超净工作台中开盖吹15-30分钟，去掉培养基表面水汽，备用。

（3）大肠菌群在大肠杆菌／大肠菌群显色培养基平板上，36℃±1℃培养18h-24h，大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。

图9 大肠菌群在大肠杆菌／大肠菌群显色培养基（第二代）平板上的菌落特征

10、MFC琼脂

（1）检验原理

  多价蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；乳糖为可发酵糖类；三号胆盐抑制革兰氏阳性菌；琼脂是培养基的凝固剂；玫红酸和苯胺蓝为pH指示剂。粪大肠菌群可在44.5℃条件下分解乳糖产酸，使培养基pH下降，菌落为亮蓝色，其他不发酵乳糖的肠道菌菌落为无色、灰色或淡红色。

（2）产品配制方法

  称取本品52.3g，加热煮沸溶解于1000mL蒸馏水中，冷却至45℃-50℃时，倾入无菌平皿，无需高压灭菌。

（3）大肠菌群在MFC琼脂平板上，44.5℃需氧培养24h±2h，典型菌落特征为蓝色菌落。

图10 大肠菌群在MFC琼脂平板上的菌落特征

11、TTC乳糖琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉为微生物的生长提供氮源、维生素和生长因子；乳糖为可发酵的糖类；溴麝香草酚兰为酸碱指示剂，变色范围为pH 6.0~7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色；Tergitol-7是选择抑制剂，可以抑制革兰氏阳性细菌生长；琼脂是培养基的凝固剂。大多数细菌能还原TTC，使之形成易于辨别的红色菌落，TTC还能减缓某些细菌的蔓延生长。

（2）产品配制方法

  称取本品53.9g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15min，冷至45℃-50℃时，每100mL培养基中加入0.05%过滤除菌TTC溶液5 mL，混匀，倾入无菌平皿，备用。

（3）大肠菌群在TTC乳糖琼脂平板上，36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落特征为红色菌落，有黄色晕圈。

大肠埃希氏菌 ATCC 25922	阴沟肠杆菌 ATCC 23355	产气肠杆菌 CMCC(B) 45103

图11 大肠菌群在TTC乳糖琼脂平板上的菌落特征

12、MI培养基

（1）检验原理

  MI琼脂中的蛋白胨可以为细菌生长提供氮、碳和氨基酸。酵母提取物提供微量元素，维生素和氨基酸。乳糖是一种可发酵的碳水化合物碳源。氯化钠保持渗透平衡。磷酸一钾和磷酸二钾具有缓冲作用。十二烷基硫酸钠和去氧胆酸钠可抑制革兰氏阳性细菌。大肠杆菌产生的β-D-葡萄糖醛酸酶将显色剂吲哚氧基-β-D-葡萄糖醛酸（IBDG）切割成蓝色或靛蓝色化合物。大肠菌群产生的β-半乳糖苷酶可裂解氟化物4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷，生产4-甲基伞形酮，一种荧光化合物，当暴露于长波紫外线（366nm）时，可出现荧光反应。琼脂作为固化剂。头孢磺啶钠可抑制革兰氏阳性细菌和一些非大肠菌群革兰氏阴性细菌生长。

（2）产品配制方法

  称取本品36.5g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，每瓶200mL，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右时，每瓶加入一支头孢磺啶钠（1mg/支），混匀，倾入无菌平皿，备用。

  注：因原料里的“十二烷基硫酸钠”成份在低温环境下容易有透明的丝状物质析出，当平板平衡到室温或是在培养过程中，此晰出物会消失，此现象不会影响产品的使用。

（3）大肠菌群在MI培养基平板上，35℃±2℃培养20h-24h，典型菌落特征为蓝色或无色菌落，有荧光。

图12 大肠菌群在MI培养基平板上的菌落特征

13、大肠菌群培养基（日本）

（1）检验原理

  蛋白胨提供微生物生长所需的碳源、氮源、维生素和生长因子；乳糖为可发酵的糖类；去氧胆酸钠和柠檬酸铁铵可抑制革兰氏阳性菌的生长；磷酸氢二钾为培养基pH缓冲剂；中性红为pH指示剂，发酵乳糖产酸的细菌菌落为红色，不发酵乳糖的细菌为无色；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂中性红的作用下形成可计数的红色，带有或不带有沉淀环的菌落。

（2）产品配制方法

  称取本品45.0g，加入1000mL精制水中，加温溶解，在培养皿中分别注入约20mL。本品不需要灭菌。

（3）大肠菌群在大肠菌群培养基（日本）平板上，36℃±1℃培养18h-24h，典型菌落为粉红色、紫红色或红色，菌落周围有或无胆盐沉淀环。

图13 大肠菌群在大肠菌群培养基（日本）平板上的菌落特征

14、远藤氏琼脂

（1）检验原理

  蛋白胨为微生物的生长提供氮源和维生素；乳糖为可发酵的糖类；琼脂是培养基的凝固剂；磷酸氢二钾为缓冲剂；亚硫酸钠和品红对革兰氏阳性菌有弱抑制作用，加入20 mL无水乙醇可以提高培养基的抑菌性。亚硫酸钠可以使碱性品红还原脱色，大肠杆菌可以发酵乳糖产生乙醛和酸，乙醛与亚硫酸钠和品红化合物结合形成紫红色菌落，快速发酵乳糖的细菌使碱性品红结晶析出，菌落产生绿色金属光泽。

（2）产品配制方法

  称取本品39.0g，加入20mL无水乙醇和980mL蒸馏水，加热搅拌溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

  注：制备好的培养基有少量沉淀。

（3）大肠菌群在远藤氏琼脂平板上，36℃±1℃培养24h±2h，形成紫红色菌落，有或稍有金属光泽。

图14 大肠菌群在远藤氏琼脂平板上的菌落特征

注：a：大肠埃希氏菌ATCC 25922；d：弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864；e：大肠埃希氏菌ATCC 8739

三、产品展示

  我公司有多种大肠菌群检测的培养基，客户可根据实际应用情况和用途进行选用。

表1 部分产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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