致泻性大肠杆菌分子生物学检测

  致泻性大肠埃希氏菌是（DiagrrheagenicEscherichia coli，DEC）是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，按目前国际上的分类主要包括六类，即肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希氏菌（ESIES）。EPEC是引起全球婴幼儿急、慢性腹泻和成年人散发腹泻的一类重要病原菌，亦可导致幼儿营养不良。

  20世纪中期，美国和英国的EPEC暴发流行时死亡率达到25%-50%。在80年代末发展中国家EPEC暴发流行时死亡率达到30%。ETEC主要感染儿童和旅行者，是发展中国家婴儿、儿童常见的腹泻病因。据估计，旅游者腹泻中75%以上是由该菌引起的。EIEC主要侵犯较大儿童和成人，引起人类细菌性痢疾。该菌的生化反应很不典型，可暴发流行或散发，亦可引起食物中毒。EHEC包括众多的血清型，尤其以于1982年被发现和识别的O157:H7引起的感染最多，引起腹泻、出血性肠炎（HC），极易继发溶血性尿毒综合症（HUS）和血栓性血小板减少性紫癜（TTP）两种严重的并发症。HUS和TTP的病死率高达30%。该菌的感染暴发主要是以食源性为主，水源性和接触传播也是其主要传播途径。

  O157:H7的感染和暴发流行多发生在发达国家，但我国近年来多数省市已有该菌的检出和感染病例报告，局部暴发流行和散发病例时有发生。目前该菌的感染无论在发达国家还是发展中国家，都受到广泛关注。我国已将EHEC列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。EPEC、ETEC、EIEC是当前我国主要检测到的三种致泻性大肠埃希氏菌。而EAEC在我国比较少见，由于致泻性大肠埃希氏菌的数量可能很少，很容易造成漏诊，因此对检测方法的灵敏度要求较高。因而对该四种致泻性大肠埃希氏菌的诊断对预防和控制由其引起腹泻的防治与流行有着十分重要的作用。

  分子生物学方法以其快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点，越来越多的应用于病原体的检测，也是近几年来的研究热点。而大肠埃希氏菌的致泻性主要取决于是否携有相应的毒力因子，因此分子生物学检测方法中大多数都是检测相关的致病因子。EPEC引起的主要组织病理学特征是感染肠上皮细胞或组织培养细胞表面形成特征性的组织病理学损伤；这种损伤叫做粘附与脱落（Attaching and effacing，A/E），引起A／E损伤最主要的一个蛋白就是由eae基因编码的紧密素（intimin）外膜蛋白。目前对EPEC的分子生物学检测重要依据是eae基因阳性但不产志贺毒素（stx）。ETEC导致感染者腹泻主要通过肠毒素的作用，肠毒素按照抗原和生物学特性不同可分成不耐热肠毒素（Heat labile enterotoxin，LT）和耐热肠毒素（Heatstable enterotoxin，ST），ETEC可只表达LT或只表达ST，或者两者都表达。长期以来ETEC分子生物学检测主要针对其肠毒素LT或ST。对EIEC的检测经常是针对ipaH、ial和virF等与毒力有关基因。EHEC致病机理在很大程度上与EPEC相似，但其产生志贺毒素（stx）。因此对EHEC的诊断主要针对stx基因、eae基因、fliC（H7抗原）基因等。

  常见的分子生物学检测方法：

一、PCR及其衍生技术（最常用的常规检测手段）

  PCR技术通过特异性引物扩增靶基因（如毒力基因或血清型基因），是DEC检测的标准之一，衍生出实时荧光定量PCR、多重PCR等技术，满足不同检测需求。

1. 普通PCR（定性检测）

  原理为针对DEC的关键靶基因（如stx1/stx2、eae、rfbE（O157）、fliC（H7））设计特异性引物，在DNA聚合酶作用下，通过“变性-退火-延伸”循环扩增靶序列，最终经琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（根据条带大小判断是否阳性）。

  操作要点有

  ①核酸提取，从样本（食品、粪便、环境样本）中富集DEC后，用试剂盒（如磁珠法、离心柱法）提取基因组DNA，去除蛋白、多糖等抑制剂；

  ②反应体系包含DNA模板、引物、dNTP、Taq酶、缓冲液等；

  ③反应条件优化，退火温度是关键，通常55℃-65℃，需根据引物Tm值调整、循环数（25-35次）；

  ④质控设置，试验必须包含阳性对照（已知DEC菌株DNA）、阴性对照（非DEC菌株DNA）、空白对照（无模板水），避免假阳性/假阴性。

  优点为操作简单、成本低、定性结果直观，适合实验室常规筛查。缺点为仅能定性、易受污染（扩增产物气溶胶导致假阳性）、需电泳后处理（耗时），无法区分活菌与死菌。

  应用场景为食品（如牛肉、生菜）、水源中DEC的初步定性检测；临床粪便样本中DEC毒力基因的快速筛查（如怀疑HUS病例时检测stx基因）。

2. 实时荧光定量PCR

  原理是在普通PCR基础上加入荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green染料），扩增过程中荧光信号随靶序列累积而增强，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现“定性（是否阳性）+定量（靶基因拷贝数，间接反映菌量）”双重目标。

  关键优势为

  ①实时荧光定量PCR技术实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、重复性好、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、同时具有实时性和准确性等特点。

  ②染料法和探针法是实时荧光PCR的两种主要方法，SYBR Green I染料是实时荧光PCR法中使用比较广泛的一种染料，它可以跟任何双链DNA结合，因此不需要设计探针，适合于任何模板的DNA，使用起来比较方便，而且便宜。染料法的特异性比TaqMan探针法差，TaqMan法对目标序列具有较高的特异性，结果重复性也比较好，引物和探针的设计相对比较简单。③高特异性，TaqMan探针仅与靶序列特异性结合，荧光信号背景低，假阳性率远低于普通PCR；高灵敏度，可检测到10²CFU/mL-10³CFU/mL的EHEC（普通PCR通常需10⁴CFU/mL以上）；无后处理污染，无需电泳，闭管检测，避免扩增产物污染；定量功能是可用于评估样本中EHEC的污染水平（如食品中菌量是否超标）。

  目前实时荧光定量PCR已广泛的应用于病原菌的检测，对于致泻性大肠埃希氏菌的检测也有报道，Ram等用分子信标法快速检测ETEC，该方法的灵敏度可达到4 CFU/mL，是常规PCR检测的500倍。目前使用多重荧光定量PCR方法对EPEC、ETEC、EIEC、EHEC四种致泻性大肠埃希氏菌也有报道。目前可以应用染料法（SYBR Green I）同时检测多种致泻性大肠埃希氏菌；通过使用实时荧光定量PCR染料法（SYBR Green I）的熔解曲线分析来检测不同的致泻性大肠埃希氏菌；还使用染料法检测stx1、stx2和eae基因以达到快速检测肠出血性大肠埃希氏菌的目的。由于SYBR Green I能结合于任何双链DNA包括引物二聚体中，产生荧光信号，所以该方法的特异性有待提高。由于没有探针结合目的DNA序列，因此检测的特异性也可能比分子信标、TaqMan法差。

二、核酸杂交技术（高特异性确认手段）

  核酸杂交基于“碱基互补配对”原理，用标记的特异性探针（如DNA探针、RNA探针）与样本中的靶核酸结合，通过检测探针信号（如放射性、荧光、化学发光）判断是否存在DEC。

1. 斑点杂交（Dot Blot）

  原理是将提取的DEC的DNA点样于硝酸纤维素膜上，与标记的靶基因探针（如stx探针）杂交，洗去未结合探针后，通过显影（如化学发光）观察斑点信号。

  特点为

  ①特异性极高（探针与靶序列的结合严格依赖碱基配对）；

  ②操作较PCR繁琐，但可作为PCR阳性结果的“确认试验”（避免PCR假阳性）。

2. 原位杂交（ISH）

  原理是将样本（如粪便涂片、组织切片）固定后，用荧光标记的探针与细胞内的DEC核酸原位结合，通过荧光显微镜观察阳性菌的位置和形态。

  优势有

  ①可定位DEC在组织中的分布（如观察DEC是否黏附于肠道黏膜细胞）；

  ②适合临床病理样本的检测（如HUS患者肠道组织中DEC的鉴定）。

三、测序技术（分型与溯源核心手段）

  测序技术通过读取DEC的核酸序列，不仅能检测毒力基因，还能实现菌株分型、进化分析和爆发溯源，是分子流行病学研究的关键工具。

1. 全基因组测序（WGS，金标准级分型）

  原理是通过高通量测序平台（如Illumina、Nanopore）读取DEC的全基因组序列，基于序列信息分析DEC的毒力基因，血清型和基因型别。

  不可替代的优势有①全面性，可以一次性获取毒力、血清型、耐药性（耐药基因）等所有关键信息；②高分辨率，SNP分析可区分同一血清型下的不同克隆株（如判断两起疫情是否由同一菌株引起）。

2. 靶向测序（针对特定基因）

  原理是仅对DEC的关键基因（如stx、eae、rfbE）进行测序，无需全基因组测序，成本更低、速度更快。

四、等温扩增技术（现场快速检测首选）

  等温扩增技术无需PCR仪的“热循环”，仅在恒温条件（通常60℃-65℃）下即可实现靶序列的高效扩增，设备要求低（如水浴锅、便携式恒温仪），适合基层实验室或现场检测。

1. 环介导等温扩增（LAMP，最成熟的等温技术）

  原理是针对靶基因（如stx2）设计6条特异性引物（识别靶序列的8个区域），在链置换DNA聚合酶（如Bst酶）作用下，恒温扩增产生大量茎环结构DNA，通过肉眼观察浊度（扩增产物沉淀）或荧光信号判断结果。

  核心优势有

  ①快速，可以在15分钟-30分钟完成扩增（PCR需1小时-2小时）；

  ②便携，无需复杂仪器，适合现场（如食品加工厂、疾控现场调查）；

  ③灵敏，检测限可达10¹CFU/mL-10²CFU/mL。

2. 重组酶聚合酶扩增（RPA，更快速的等温技术）

  原理是在重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶协同作用下，恒温（37℃-42℃）快速扩增靶序列，10分钟-15分钟即可出结果，可结合侧向流试纸条（LFD）实现“肉眼判读”（阳性出现条带）。

  优势为

  ①超快速，相较于LAMP，所用时间更短，适合应急检测；

  ②抗干扰，对样本中的抑制剂（如食品中的多糖、粪便中的蛋白）耐受性强，可简化样本前处理（如直接用煮沸法提取DNA）。

五、基因芯片技术（高通量筛查）

  基因芯片将大量DEC特异性探针（如毒力基因探针、血清型探针、耐药基因探针）固定于芯片表面，与样本核酸杂交后，通过芯片扫描仪检测信号，实现“一次反应检测数百个靶标”。

  该技术有利于建立快速、灵敏的细菌病原体鉴别诊断的自动分析系统，具有广阔的应用前景。目前有人应用基因芯片技术同时检测大肠埃希氏菌的多重毒力基因以及抗性基因。但是该方法假阳性率比较高，仪器设备比较昂贵，需要专业人员操作，不能广泛应用于基层实验室

  除以上介绍的方法之外，其它一些检测方法有噬菌体分型、脉冲场电（PFGE）、限制片段长度多态性（RFLP）和扩增片段长度多态性（AFLP）分析、细胞毒性试验等也应用在致泻性大肠埃希氏菌的检测中。虽然传统检测方法费时费力，但仍然是目前检测的金标准，而随着研究的不断深入，检测方法的改进和提高，相信在不久的将来会实现快速、特异、准确、灵敏、大规模的检测致泻性大肠埃希氏菌，对快速有效的实施针对治疗，及时救治生命，预防食物中毒，保障公众健康具有重大意义。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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