炭抗原

【成分】

【制法】

  1.冻融法：制备抗原将浓缩100倍的钩端螺旋体菌悬液置低温冰箱中使之完全冻结，取出放于37℃水浴中迅速解冻，如此反复冻融15次以上，用暗视野检查，如无完整钩端螺旋体，以1000转/分离心10分钟，取上清即为冻融抗原，可加入1/4叠氮钠防腐，保存冰箱备用。

  2.钩端螺旋体致敏炭粒的抗原滴定：将所制抗原用生理盐水作1：2,1：4,1：8,1：16倍稀释，每个稀释度抗原4ml,加活性炭0.2g，于超声波清洗槽内隔水作用15分钟，制成炭抗原，与不同稀释度相应免疫血清作液板炭凝集试验，找出某个稀释度抗原致敏的活性炭微粒能与1：200滴度的免疫血清出现明显凝集者，即为本批抗原的致敏稀释度。

  3.炭抗原制备：将已作致敏稀释度测定的抗原用生理盐水用1：4稀释，按20:1(V/W)加入活性炭(即20ml稀释抗原加1g活性炭)置于三角瓶中混匀，在超声波清洗槽内作用15分钟，取出再置37℃孵箱中1小时使吸附稳定(也可用研钵研磨结合30分钟）取出，以3000转/分离心5分钟，去上清，沉淀炭粒中加入正常兔血清(每克活性炭加1.5ml)，并用滴管充分吹打，使炭粒自凝消除。再加1%正常兔血清盐水使炭粒悬浮（加量30：1)，充分混匀，以500转/分离心2分钟使粗细粒分开（沉淀粗炭粒保存，可回收)，吸出上层液于另一试管中（含有细炭粒)，再以3000转/分离心10分钟，使细炭粒沉淀，沉淀炭粒用2%正常兔血清1%硼酸盐水洗涤1～2次，然后将细炭粒悬浮于2%正常兔血清1%硼酸盐水中（其比例是每g活性炭的第1次细炭粒悬于10ml中)，加入1/4叠氮钠防腐，分装小瓶即为炭抗原保存冰箱内，备用。

  4.炭抗原的鉴定：取与炭抗原相应的钩端螺旋体免疫血清，用1%正常兔血清生理盐水在塑料凹孔板上作倍量稀释，取各稀释度血清1滴(0.05ml)依次置于试验玻板瓷漆孔下半部，最后1滴加正常兔血清盐水作对照。用毛细滴管吸取制备好的炭抗原，分别加1小滴于瓷漆孔上半部(加炭抗原的毛细口滴管切勿与试验血清接触，因炭抗原的量极少，其加入后的血清稀释度可忽略不计)，然后用小圆头玻璃自高稀释度孔至低稀释度孔将炭抗原与稀释血清轻轻磨匀(炭抗原量要适当，以加入后混匀呈淡灰色为好），取出充分摇动玻板，至见不到炭粒沉淀为止。室温（20℃以上)静置10分钟，取出，在3号光白色背景或日光灯上向一个方向轻轻摇动玻板，待炭粒慢慢聚集于液滴中央时观察结果。如免疫血清稀释至32~64倍后，能出现十十以上凝集，对正常人血清及兔血清盐水不应有任何凝集现象，则为合格。

【用途】

  用于钩端螺旋体的间接炭凝试验。

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