1. 引言
在微生物检测中，使用测试片已成为传统平板方法的有效替代方案。它们操作简便、节省空间，并广泛用于食品、饮料、环境和水质等领域的菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7等多种微生物的计数和确认。当检测结果需要进一步鉴定（如生化试验、血清学试验、分子生物学检测等）时，或者需要分离纯培养物时，从测试片上准确挑取典型菌落是至关重要的步骤。本指南旨在详细说明如何安全、有效地从测试片上挑取典型菌落。
2. 准备工作
•无菌环境： 必须在生物安全柜或洁净工作台内进行操作，确保无菌环境，最大限度减少污染风险。
•个人防护： 穿戴好实验服、手套、口罩（必要时佩戴护目镜）。
•工具准备：
无菌接种环或无菌牙签/一次性接种针： 这是挑取菌落的核心工具。金属接种环需提前在酒精灯或本生灯火焰上彻底灼烧灭菌，并在空气中冷却数秒（避免过热杀死菌落或使测试片塑料熔化）。一次性无菌塑料接种环或牙签更为便捷安全。
无菌培养基： 准备接收挑取菌落的适当培养基。通常是：
营养琼脂平板 (TSA/NA)： 用于菌落总数、霉菌酵母等的纯化或传代。
选择性/鉴别性琼脂平板： 如Baird-Parker琼脂（金黄色葡萄球菌）、VRBA琼脂（大肠菌群）、XLD琼脂（沙门氏菌/志贺氏菌）等，用于特定目标菌的确认或纯化。
注意： 确保培养基已凝固，表面无水珠。
酒精灯或本生灯： 用于灼烧金属接种环柄部和维持操作区域附近的无菌区。
标记笔： 用于标记培养基平板。
待挑取测试片： 在适宜条件下培养完成、具有可计数菌落的测试片。
70-75% 乙醇： 用于消毒工作台面和双手（戴手套后）。
生物危害废物容器： 用于丢弃使用过的测试片、一次性工具等。
3. 识别典型菌落
•熟悉目标菌落特征： 这是最关键的一步。 在挑取前，必须充分了解在特定测试片上目标微生物的典型菌落形态、颜色、大小、边缘特征等（参考测试片说明书或相关标准）。
例如：
菌落总数测试片： 红色菌落（可能带有气泡），通常所有红色菌落都视为需氧菌落。
大肠菌群/大肠杆菌测试片： 典型大肠菌群为红色菌落带气泡；大肠杆菌为蓝色菌落带气泡（或根据具体测试片型号）。
金黄色葡萄球菌测试片： 紫红色菌落，周围有白色或浅色晕圈（卵磷脂酶反应）。
霉菌酵母测试片： 霉菌菌落通常呈毛状、扩散状，颜色多样；酵母菌落通常较小、光滑、凸起，多为白色、奶油色或粉红色。
•排除非典型菌落： 注意区分目标菌落与可能存在的非目标菌落、蔓延菌落或污染菌落。
•选择目标菌落： 在符合计数规则的区域内（如远离边缘、无蔓延、无气泡干扰等），选择形态典型、孤立、生长良好的单个菌落进行挑取。优先选择中等大小的菌落（过大可能老化或包含杂菌，过小可能活力不足）。
4. 挑取典型菌落操作步骤
1.点燃酒精灯/本生灯： 在工作区域附近点燃火焰，创建无菌区。
2.摆放测试片和培养基： 将待挑取的测试片和接收用的无菌琼脂平板放在安全柜/工作台内合适位置。
3.工具灭菌/准备：
若使用金属接种环：手持接种环柄，将金属丝部分垂直置于火焰最热处（外焰顶部）灼烧至通红，然后缓慢将整个金属丝部分通过火焰数次，确保彻底灭菌。将接种环移出火焰，在空气中冷却5-10秒（避免接触任何物品）。冷却时，可将环部靠近但不接触火焰旁的无菌区域。
若使用一次性无菌牙签/塑料接种环：从无菌包装中取出即可使用，注意保持前端无菌，避免触碰非目标区域。
4.打开测试片： 小心揭开测试片的上层覆盖膜。注意动作轻柔，避免快速掀开导致气流扰动菌落或造成污染。
5.挑取菌落：
将冷却的无菌接种环前端或一次性无菌牙签的尖端，轻轻接触所选典型菌落的中心或边缘。
动作要轻、准、稳。 只需蘸取少量菌体即可，不必挖取整个菌落或深入凝胶层。避免用力过猛戳破凝胶或带起过多凝胶物质。
避免交叉污染： 挑取一个菌落后，如需挑取另一个菌落，必须更换新的无菌工具（或对金属环重新彻底灼烧灭菌并冷却）。绝对禁止用同一个未灭菌的工具连续挑取不同菌落！
6.转接至培养基：
左手拿起准备好的无菌琼脂平板，在火焰旁用拇指和食指（或手掌边缘）小心打开皿盖，角度尽量小（刚好能伸入工具即可），暴露部分琼脂表面。
将沾有菌落的工具（环或牙签）迅速伸入打开的平板内。
划线分离法（推荐）： 在琼脂表面进行分区划线（如四区划线法），这是获得单菌落、确保纯培养的最佳方法。第一区可稍微密集，然后依次在后续区域轻划，工具上的菌量会逐渐减少。
点种法： 如果仅需转接确认，可将菌落轻轻点在平板中央或特定位置（但此法不易获得纯培养）。
操作过程中，持工具的手和打开的皿盖不要从火焰上方经过，也不要触碰琼脂表面或平板边缘。
7.完成转接：
转接完成后，迅速盖上皿盖。
如果使用金属接种环，立即将其重新在火焰上彻底灼烧灭菌。
用标记笔在平板底部清晰标记样品信息、日期、挑取的菌落编号（如Colony 1, 2...）或目标菌种等信息。
8.处理测试片： 挑取完成后，立即将使用过的测试片放入生物危害废物袋/容器中。盖上测试片盖膜（如果方便）有助于减少气溶胶。
9.重复操作： 如需挑取多个典型菌落，重复步骤3-8，每次挑取都必须使用新的无菌工具或彻底灭菌并冷却后的金属环。
5. 后续操作
•将接种好的琼脂平板倒置（盖在下，底在上），放入适宜温度（如35-37°C）的培养箱中进行培养。
•培养适当时间（通常18-24小时或根据目标菌确定）后，观察平板上是否长出纯菌落。如果进行了划线分离，应在最后划线区域看到孤立的单个菌落。
•挑取这些单菌落进行后续的鉴定试验（如革兰氏染色、生化试验、血清学试验、PCR等）。
6. 注意事项
•无菌操作是核心： 整个操作过程必须严格遵守无菌操作规程。任何疏忽都可能导致交叉污染或假阳性/假阴性结果。
•工具冷却至关重要： 灼烧后的金属接种环必须充分冷却后再接触菌落或琼脂，否则会烫死微生物或熔化测试片凝胶/琼脂。
•轻触勿深挖： 仅需蘸取菌落表面菌体，避免破坏测试片结构或带出过多凝胶。
•避免气流扰动： 在生物安全柜内操作时也要注意动作轻柔，揭盖和挑取时避免产生快速气流。
•一菌一工具： 这是防止交叉污染的铁律。
•及时标记： 转接后立即清晰标记平板，避免混淆。
•熟悉目标特征： 对测试片上目标菌和非目标菌的典型形态有准确的认知是成功挑取的前提。不确定时，应查阅标准或请教有经验者。
•培养基适用性： 确保接收培养基适合目标菌的生长和后续试验要求。
•安全处置： 所有接触过微生物的材料（测试片、使用过的工具、手套等）都必须作为生物危害废物妥善处理。
7. 结论
从测试片上准确挑取典型菌落是微生物检测流程中连接初步计数与最终确认/鉴定的关键环节。熟练掌握无菌操作技术、深刻理解目标菌落的形态特征、并严格遵循标准操作步骤，是获得可靠纯培养物、确保后续鉴定结果准确性的基础。操作者应始终保持谨慎和规范，以保障检测结果的质量和实验室的生物安全。
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