近岸河流水域微生物检测-总大肠菌群的测定滤膜法

引言

  微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水中常含有一定数量的病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中较为常见且具有重要影响的包括：沙门氏菌属、志贺氏菌属、粪链球菌、肠道病原性大肠埃希氏菌以及肠道病毒等。

  前篇已简述总大肠菌群的概念及多管发酵法的内容，本文将继续介绍另外两种测定总大肠菌群的方法。

  对于其他近岸河流水微生物检测的相关内容可参考《近岸河流水域微生物检测-沙门氏菌属的测定》、《近岸河流水域微生物检测-粪链球菌测定多管发酵法》等文章。

一、总大肠菌群的测定—滤膜法

  滤膜法所用的是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45 μm）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，进行培养。因大肠菌群细菌可发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1 L水样中含有总大肠菌群数。如有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管做进一步鉴定。

  滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵技术更快地获得肯定的结果。不过在检验混浊度高、非大肠杆菌类细菌密度大的水样时，有其局限性。

  多管发酵法和滤膜法的结果作统计学比较，可显示出后者较为精密。虽然从这两种技术所得到的数据都提供了基本相同的水质情报，但检验结果的数值不同。在做水源水的检验时，可以预期约有80%的滤膜试验的数据落在多管发酵试验数据95%的置信界限内。

1.培养基

  （1）品红亚硫酸钠培养基HB0118品红亚硫酸钠琼脂

  （2）乳糖蛋白胨培养液HB0119乳糖蛋白胨培养液

  （3）乳糖蛋白胨半固体培养基HB8463乳糖蛋白胨半固体培养基

2.步骤

  （1）过滤水样

  ① 滤膜及滤器的灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15 min，也可使用市面上的无菌滤膜。前两次煮沸后需更换水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。也可用121℃灭菌10 min，灭菌后迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。

  滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30 min。

  滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

  ② 过滤装置安装：以无菌操作把滤器、接液瓶、缓冲瓶、真空泵依次连接安装。

  ③ 水样量的选择：待过滤水样量是根据所预测的细菌密度而定的（见表1对总大肠菌群做滤膜试验应过滤水样的参考体积）。

一个理想的水样体积，可以产生大约50 CFU大肠菌群细菌菌落，而全部类别的菌落数则不超过200 CFU。当过滤水样体积少于20 mL时，应在过滤之前加少量的无菌稀释水到过滤漏斗中，以便水量的增加有助于悬浮的细菌均匀分布在整个过滤表面。

  ④过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。

表1对总大肠菌群做滤膜试验应过滤水样的参考体积

（2）培养

  水样抽滤完后，再抽约5 s，关上滤器阀门取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24 h。培养期间，保持充足的湿度（大约90%相对湿度）。

3.结果观察和报告

  挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。如图1

图1 大肠菌群在品红亚硫酸钠培养基上的特征

  凡系革兰氏阴性无芽孢杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基（接种前应将此培养基放入水浴中煮沸排气，冷却凝固后方能使用），经37℃培养，前者于24 h产酸产气，如图2；或后者经6 h~8 h培养后产气，如图3，则判为总大肠菌群阳性。

图2 大肠菌群在乳糖蛋白胨培养液中的阳性情况

图3 不同细菌在乳糖蛋白胨半固体培养基上的生长特征

  计数滤膜上生长的大肠菌群菌落总数，根据过滤的水样量计算1 L水样中总大肠菌群

  滤膜上菌落数以20 CFU-60 CFU/片较为适宜。

二、相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有适用于水中大肠菌群检验的相关培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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