斜面培养基的制备与划线

  斜面培养基是一种固体培养基，是微生物培养中常用的培养基形式，通过将灭菌后的固体培养基在试管中倾斜放置，凝固后形成斜面。这种形式的培养基适用于菌种的扩大转管和保存，能够提供足够的营养以支持微生物的生长。斜面培养基因其操作简单、成本低、适合短期保存而被广泛用于菌种的保存。

一、斜面培养基制备

1、材料准备

  固体培养基（根据培养微生物类型选择，如营养琼脂培养基、胰胨大豆琼脂培养基等）、试管（15 mm×150 mm等规格）、试管塞或盖子、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、试管架、记号笔、温度计、绳子或橡皮筋。

  环境与试剂要求，操作全程在超净工作台内进行，提前紫外线消毒30 min以上，开启超净工作台风机，保证无菌环境。固体培养基需提前高压蒸汽灭菌（121℃条件下灭菌15 min -20 min），灭菌后待温度降至50℃-60℃。

  试管及试管塞或盖子需提前灭菌，灭菌后放入超净工作台内，紫外线消毒30 min以上。

2、具体操作步骤

  （1）培养基准备。从高压蒸汽灭菌锅中取出灭菌后的固体培养基，在超净工作台外轻轻摇晃，使琼脂均匀分布，避免沉淀。将培养基放入50℃-60℃水浴锅中，待温度降至50℃-60℃。温度过高可能导致试管变形或污染风险增加；温度过低会使培养基提前凝固，无法顺利分装。

  优化培养基的质地与状态可避免划破培养基。确保营养琼脂的琼脂含量在1.5%-2%，这个浓度的培养基硬度适中，不易被划破；若琼脂浓度过低，培养基偏软，极易被接种环戳破。斜面需完全凝固后再接种，未凝固的琼脂呈半流动状态，划线时很容易被划破且会导致菌种扩散。提前去除斜面的冷凝水，有水珠的琼脂表面光滑湿滑，接种环容易打滑，进而划破培养基。

  （2）试管准备。在超净工作台内，用酒精棉球擦拭双手。将灭菌后的试管整齐排列在试管架上，准备分装培养基。

  （3）分装培养基。右手握住装有培养基的三角瓶，在酒精灯火焰附近，打开封口膜后灼烧瓶口灭菌。使用移液枪吸取相同体积的培养基于试管中，加入培养基时，要控制分装速度，避免产生气泡，若将培养基装入试管中的速度过快会产生气泡影响划线甚至影响菌生长（如图1），防止培养基溅出试管外。每个试管加入约试管长度的1/4-1/3体积，不能过长（如图2）。

图1斜面培养基的气泡

图2 不同长度的斜面培养基

  （4）加塞与摆放。分装完成后，立即在酒精灯火焰附近盖上试管塞或盖子。将试管取出，倾斜放置在试管架上（倾斜角度约30°-45°），使培养基自然凝固形成斜面。培养基状态要达标，确保琼脂斜面凝固完全、硬度适中，未完全凝固的琼脂质地偏软，极易被接种环划破；若琼脂浓度偏低（通常营养琼脂琼脂含量为1.5%-2%），也会导致硬度不足。提前去除斜面的冷凝水，有水珠的斜面表面光滑湿滑，接种环容易打滑并划破琼脂。

  （5）标记与储存。培养基完全凝固后，用记号笔在试管外壁标记培养基名称、配制日期、操作者等信息。若暂时不使用，可将试管直立放入2℃-8℃冰箱中储存，储存时间一般不超过1个月。

二、斜面培养基划线

  操作时需严格遵循无菌条件，具体步骤包括：

  （1）将装有新鲜配制的斜面培养基菌种保藏管的管壁上注明菌名及接种日期和传代菌种，移入洁净工作台，打开紫外灯照射30 min-1 h。关闭紫外灯。

  （2）接种环取菌。使用斜面菌种取菌。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种环后端，将接种环烧红约30 s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，轻轻拔开管塞或打开盖子，或者左手将管口在火焰上旋转烧灼，并直接打开斜面盖子；将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种环并将菌种管口移至火焰上方，塞上管塞，左手将菌种管放下。

  使用菌平板取菌。点燃酒精灯，右手持接种环，将接种环烧红约30 s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。左手持菌平板，用拇指和食指捏住平板边缘，在酒精灯火焰旁呈45°角缓慢揭开平板盖（仅揭开一侧，避免完全打开暴露在空气中）。接种环在无菌的琼脂上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，关闭菌平板。

  （3）划线接菌。取配制好琼脂斜面一支，照上述操作打开管塞或打开盖子，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，自下而上进行“之”字形划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。取岀接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子或直接盖上盖子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

  在琼脂斜面划线接种时，避免划破培养基的核心是控制接种环的状态和操作力度，再配合规范的手法，具体可以从以下几个方面入手：

  ①接种环预处理要到位

  接种环灼烧灭菌后，必须充分冷却，冷却后的接种环尖端质地较软，不易划破琼脂；若未冷却直接接触培养基，高温不仅会烫死菌种，还会因琼脂局部受热软化，更容易被划破。可将接种环尖端轻触斜面空白的琼脂边缘，触感无融化、无黏滞感即可；也可在无菌培养皿内冷却10 s-20 s。

  选择环口光滑的接种环，避免使用尖端变形、有毛刺的接种环，这类接种环极易划破培养基表面。

  使用接种环划斜面时，可用镊子将铁环部分稍微弯曲，使其有弧度进行划线，并且尽量不使用接种环整个接触斜面进行划线（如图3），可以使用接种环前端1/4-1/3接触斜面进行划线（如图4），这样可避免线出现重合，使所划线清晰。

图3 接种环整个接触斜面进行划线

图4 接种环前端1/4-1/3接触斜面进行划线

  ②操作手法要轻柔规范

  划线时，保持接种环与斜面琼脂表面平行，以“轻贴”而非“按压”的方式移动；发力方向沿斜面长度方向，不要向下用力戳压，否则会使斜面断裂。划线路径选择从斜面底部向顶端的平缓区域，避开试管弯折处的琼脂（此处较薄，易被划破）；采用连续“之”形划线时，转弯动作要柔和，避免急转导致接种环切入琼脂（如图5）。

图5 断裂的斜面

  整个操作过程中，手臂保持稳定，不要抖动；试管倾斜角度适中（约30°-45°），便于视线观察接种环与琼脂的接触状态。划线时要覆盖整个斜面（如图6D），不能划线不完全（如图6ABC），影响后续的使用与保存。

图6 划线的斜面

ABC为划线不完全的斜面，D为正常划线的斜面

  （4）结束处理：划线完毕后，试管口过火焰，塞上塞子或盖上盖子（勿用试管口迎塞子）或者盖上盖子并将盖子锁住，接种环灼烧灭菌后收好。

三、注意事项

  1. 无菌操作要注意全程严格遵守无菌操作规范，超净工作台内物品摆放合理，避免无关物品干扰。

  2. 培养基温度要严格控制分装时的温度，确保培养基既能顺利流动，又不会因高温造成污染或容器损坏。

  3. 防止污染，分装前后需灼烧瓶口，试管塞或盖子灭菌合格，操作过程中避免试管口长时间暴露在空气中。

  4. 斜面规格要控制斜面长度和倾斜角度，保证微生物生长有足够空间，同时便于接种工具操作。

  5. 安全操作，使用高压蒸汽灭菌锅时遵循操作规程，搬运灭菌后培养基时注意防烫；废弃培养基需按规定处理，避免污染环境。

  斜面培养基的质量直接影响微生物的保存和培养效果，严格按照上述步骤操作，可制备出合格的斜面培养基，为微生物的传代、保藏等实验提供可靠保障。

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