组织细胞培养基

【原理】

  Mccoy细胞，对衣原体敏感，适合其生长。用组织细胞培养和鸡胚卵黄囊接种法分离沙眼衣原体其敏感性基本上一致，但组织细胞培养法设备简单，操作简便，可以同时筛选大量的标本。

【成分】

  Mccoy组织细胞（或Hela细胞）若干g

  199综合营养液（含10%灭活牛血清）若干ml

  维持液(含5%血清）若干ml

【制法】

  参见本书立克次体的培养基，原则如下。

  分离或培养衣原体最常用的是McCoy细胞，对衣原体敏感，适于生长。也曾用过BHK-21、HeLa、HeLa229等细胞。细胞培养应用的培养液，用Eagle氏基础营养液或用199综合营养液中加入10%灭活牛血清(最好使用胎牛血清)。链霉素加100~200μg/ml。维持液血清含量为5%。致密的单层细胞的消化,可用0.1%胰酶或0.02%EDTA消化后制备的细胞悬液，分装于两种培养瓶中培养：①链霉素瓶，每瓶装量1ml;②角型培养瓶，每瓶装量为5ml。分装后的细胞，经24小时培养，如形成单层，即供分离或培养衣原体用。

【用途】

  培养分离鹦鹉热、沙眼和性病淋巴肉芽肿衣原体。

  方法：

  ①取已形成单层的致密细胞，用0.1%胰酶或0.02%EDTA消化后制备的悬液，按量分装于上述培养瓶中，同时每一培养瓶中加入一小片盖玻片，置37℃培养箱，一般24小时可形成致密的单层细胞，然后用5000伦琴辐射予以照射，辐射处理后的细胞即可接种待分离或传代材料，每份材料接种6~10瓶,用链霉素小瓶,每瓶接种0.2ml;用角型瓶，每瓶接种1ml,于36~37℃吸附2小时后，用维持液洗液2~3次，最后加入生长液，前者1ml，后者5ml。沙眼衣原体一般在36~37℃培养3~4天,鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿需培养10天，然后再行传代或低温（-40℃~-70℃)保存。玻片培养片可从培养后65小时起，按不同时间取出染色，镜检，观察衣原体在细胞内生长情况；

  ②将已接种感染材料的细胞经1~7天培养后，将经培养的细胞再移种于特制的玻片的圆环中，放置平皿中，在CO2培养内培养65小时后，分别取出染色、镜检。培养瓶内细胞培养和接种感染材料等程序同上法。

【注意事项】

  1.用细胞培养法分离衣原体所用的感染材料比用动物、鸡胚分离要求严格，采集标本时应采取无菌操作，标本应及时低温保存或放在适宜保存液中，以防细菌污染或丧失衣原体活性，在处理标本时也应注意温度条件。现以分离沙眼衣原体为例：最好使用灭菌拭子取眼结膜刮屑，及时放在蔗糖磷酸盐抗生素溶液中,然后密封放液氨中保存,或保存液中加3%胎牛血清保存，这样取材和处理才适用于细胞分离。

  2.分离衣原体和传代用的McCoy细胞必须先经辐射照射，如果简化手续，不照射，就用于分离培养，则不适于衣原体包涵体形成，很难找到包涵体。

  3.接种细胞的临床标本可用刮刀或拭子采集，作拭子用的材料很重要，有的棉花有妨碍衣原体的生长的作用，如用涤纶材料作拭子，又会影响碘染色，最好使用藻朊作拭子，可以避免上述缺点。采集标本的保存液应含有下列抗生素：链霉素200μg/ml(或庆大霉素10μg/ml),万古霉素100μg/ml,二性霉素B5μg/ml。

  4.取采集的临床标本置于保存液中。分离时，以2700~3000g离心沉淀1小时(离心时的温度应保持在33~35℃)，然后置换细胞生长液，按上述方法接种细胞进行分离传代，用McCoy细胞分离沙眼衣原体，如果是阳性材料，第1代阳性率可达90%。3~4天可传一代，鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿衣原体繁殖较慢，细胞培养需10天，但均较鸡胚卵黄囊和小白鼠接种法早。同时有鹦鹉热衣原体不引起小白鼠死亡者，所以使用细胞培养法分离衣原体有其优越性。

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