高糖类培养基美拉德反应的影响因素研究（下）

一、引言

  美拉德反应（Maillard Reaction）是还原糖与氨基酸、蛋白质在加热或长期储存条件下发生的非酶促褐变反应，该反应无需酶参与，仅由温度、反应时间、物料接触状态等因素调控。反应过程中不仅会生成棕黑色类黑素色素，导致体系褐变，还会消耗培养基中的还原糖、氨基酸等关键营养成分，甚至产生对微生物生长不利的副产物。沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）与MRS培养基均为微生物培养中常用的高糖类培养基，前者广泛应用于真菌培养，后者适用于乳酸菌增殖，二者的营养成分完整性直接影响菌种的生长速率、菌落形态及检测准确性。《GB 4789.28-2024》中SDA与MRS的制备方式为加热溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min备用。在实际制备过程中，灭菌作为核心环节，其设备选型、参数设置及后续处理方式常导致培养基褐变程度差异，进而影响使用效果。目前关于灭菌相关条件对高糖类培养基美拉德反应的系统研究较少，因此本试验通过设置多组变量，探究不同条件对SDA和MRS培养基褐变的影响，明确美拉德反应的关键影响因素，为培养基标准化制备提供理论依据与技术支撑。

二、试验与结论

1.灭菌前处理方式试验

  （1）控制条件：配制200 mL培养基，121℃、15 min灭菌。

  （2）变量条件：灭菌前分别进行不晃动、晃匀（培养基粉末完全溶解）、水浴加热（粉末完全溶解）、直接加热（加热溶解至煮沸）处理。

  （3）结论

  SDA培养基在瓶装状态下，不同预处理方式的褐变差异不明显（图1），但倾入平皿后可观察到：直接加热组褐变最重（深棕色），不晃动组次之（棕色），晃匀组和水浴加热组最轻（浅棕色）（图2）。MRS培养基在瓶装状态下已呈现显著差异，褐变程度由深至浅依次为：不晃动组（深棕色）＞水浴加热组（棕色）＞直接加热组（浅棕色）＞晃匀组（浅黄色）（图3），倾入平皿后该排序保持一致（图4）。这表明灭菌前物料混合状态是影响美拉德反应的关键因素，晃匀处理可促进还原糖与氨基酸的均匀分散，避免局部浓度过高导致反应加剧；而不晃动处理使物料局部聚集，反应更集中。MRS培养基对预处理方式更敏感，可能与其氨基酸含量更高有关。

  回收率试验结果表明，SDA与MRS两种培养基经121℃、15 min灭菌处理后，在目标菌数≥100 CFU的条件下，不同灭菌前预处理方式对回收率影响显著：直接加热组培养基回收率最高，水浴加热组回收率居中，不晃组与晃匀组回收率最低；其中不晃组与晃匀组的回收率仅为直接加热组的50%，水浴加热组回收率为直接加热组的70%。

图1 SDA灭菌后颜色

图2 MRS灭菌后颜色

图3 SDA倾入平皿后颜色

图4 MRS倾入平皿后颜色

2.不同灭菌时间试验

  （1）控制条件：配制200 mL培养基，121℃灭菌。

  （2）变量条件：灭菌时间分别设置为10 min、15 min、20 min、30 min。

  （3）结论

  随着灭菌时间延长，SDA和MRS培养基的褐变程度逐渐加深（图5~图8）。10 min灭菌组呈浅黄色（无明显褐变），15 min组为浅棕色，20 min组为棕色，30 min组为深棕色。其中，SDA培养基在10~15 min阶段褐变程度变化较小，20 min后显著加剧；MRS培养基在15 min后褐变速率明显加快，30 min组褐变最为严重。这说明灭菌时间与美拉德反应呈正相关，延长灭菌时间会直接增加反应持续时间，导致营养成分消耗增多，褐变程度加剧。但《GB 4789.28-2024》中规定了SDA与MRS的灭菌时间为15 min，灭菌10 min时虽褐变程度较小，但因不符合国家标准而不具备适用性。

  回收率试验结果表明，SDA与MRS两种培养基经121℃灭菌处理后，在目标菌数≥100 CFU的条件下，121℃灭菌时长对SDA与MRS两种培养基的目标菌回收率存在显著影响。其中，灭菌10 min组与15 min组的回收率差异较小，但10 min组的培养基平板出现杂菌污染，提示该灭菌时长未能达到彻底灭菌的效果；延长灭菌时间至20 min时，目标菌回收率仅为15 min组的70%；当灭菌时间进一步增至30 min，回收率大幅下降，仅为15 min组的50%。

图5 SDA不同灭菌时间

图6 MRS不同灭菌时间

图7 SDA倾入平皿后颜色

图8 MRS倾入平皿后颜色

3.不同灭菌温度试验

  （1）控制条件：配制200 mL培养基，121℃灭菌。

  （2）变量条件：灭菌温度分别设置为110℃、115℃、121℃。

  （3）结论

  培养基褐变程度随灭菌时长的延长呈逐渐加深的趋势（图9~图10）。其中，SDA培养基在不同灭菌温度条件下的颜色差异相对较小；而MRS培养基的褐变程度对灭菌温度更为敏感，尤以121℃灭菌组的褐变程度变化最为显著。需注意的是，依据《GB 4789.28-2024》的规范要求，SDA与MRS培养基的标准灭菌温度为121℃，尽管其他灭菌温度下培养基褐变程度更轻，但因不符合国家标准而不具备适用性。

  回收率试验结果显示，当灭菌时长固定为15 min、目标菌浓度≥100 CFU时，灭菌温度对SDA与MRS两种培养基的目标菌回收率无显著影响；但110℃与115℃灭菌组的培养基平板均出现杂菌污染，提示该温度条件下的灭菌操作未达到完全灭菌的效果。

图9 SDA不同灭菌温度

图10 MRS不同灭菌温度

三、讨论

  美拉德反应的本质是还原糖与氨基化合物的缩合、重排、裂解及聚合反应，温度、反应时间、物料接触状态是调控该反应的核心因素。本研究中，大灭菌锅处理导致的褐变加剧，本质是高温累积效应；灭菌后70℃取出与延长灭菌时间的作用机制相似，均通过增加中高温阶段的持续时间，促进类黑素生成。而灭菌前晃匀处理则通过优化物料分散状态，降低局部反应浓度，从而抑制褐变，这与张莉等关于物料混合均匀度对美拉德反应影响的研究结果一致。

  SDA与MRS培养基的褐变差异，可能与二者的营养成分组成有关。MRS培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物等多种高蛋白成分，氨基酸种类更丰富，与还原糖的反应位点更多，因此对试验条件更敏感，褐变程度整体高于SDA培养基。此外，MRS培养基中的乙酸钠、柠檬酸二铵等成分可能影响体系pH值，间接调控美拉德反应速率，这一推测需通过pH调控试验进一步验证。

  在微生物培养中，美拉德反应不仅导致培养基褐变，还会消耗葡萄糖、氨基酸等营养物质，降低培养基的营养供给能力，同时类黑素可能对部分菌种（如乳酸菌、酵母菌）的生长产生抑制作用。因此，结合本研究结果，实际制备高糖类培养基时，建议采用小规格灭菌锅处理小体积培养基、灭菌后95℃及时取出、灭菌前充分晃匀、控制灭菌温度在121℃、时间在15 min，并采用自然冷却方式，以最大程度抑制美拉德反应，保障培养基的营养品质与使用效果。

四、总结

  本研究系统探究了灭菌相关条件对高糖类培养基（SDA、MRS）美拉德反应的影响，得出以下结论：

  灭菌锅规格、灭菌后取出温度、灭菌时间、灭菌温度及灭菌前预处理方式对美拉德反应有显著影响，其中大灭菌锅、70℃取出、灭菌时间≥20 min、灭菌前不晃动或直接加热会显著加剧褐变；

  冷却方式对褐变影响较小，自然冷却与快速冷却无显著差异；

  MRS培养基对试验条件的敏感度高于SDA培养基，褐变程度整体更重；

  优化后的高糖类培养基制备条件为：小规格灭菌锅处理、121℃灭菌15 min、灭菌后95℃及时取出、灭菌前充分晃匀、自然冷却，可有效抑制美拉德反应，保障培养基营养完整性。

五、产品展示

  试验中培养基均为我公司产品，客户可根据实际应用情况和用途进行选用。

表1 部分产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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