细胞培养液接种硫乙醇酸盐试管培养后为什么会出现异物?

  硫乙醇酸盐流体培养基主要用于培养需氧、厌氧和微需氧微生物，是培养厌氧菌的首选培养基。硫乙醇酸盐流体培养基的营养较全面，能满足绝大多数细菌的营养需求，且该培养基的上层、中层、下层部位可以分别模拟提供有氧、弱氧至无氧的不同含氧量梯度环境，使厌氧细菌、兼性厌氧细菌、好氧菌均可生长，在药典中被用于药品、生物制品无菌检测，具有重要作用。

  硫乙醇酸盐流体培养基含有多种营养成分，其中胰酪蛋白胨、酵母浸出粉提供氮源、维生素、生长因子等；葡萄糖提供碳源；氯化钠维持均衡的渗透压；胱氨酸、硫乙醇酸盐可降低氧化还原电位，防止积累过氧化物抑制某些细菌生长；刃天青作为氧化还原指示剂，被氧化时呈红色；琼脂可以防止液体对流，防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散，有利于厌氧环境的形成。

  在实际操作中，部分实验者发现在使用装有硫乙醇酸盐流体培养基的玻璃试管对细胞培养液进行无菌检查时，将细胞上清液加入到试管内，培养一晚后有絮状物出现，空白对照无此类现象，易与微生物污染导致的浑浊混淆，干扰检测结果判定。本文针对这一现象设计实验进行探究，并就出现该现象的原因进行了分析。

图1硫乙醇酸盐流体培养基培养细胞上清液一段时间后出现析出物

一、试验探究

  采用试管装的硫乙醇酸盐流体培养基，分别向其中加入1 mL不离心的细胞培养上清液、经过1200 rpm离心3 min后上清液、未使用的细胞完全培养基（基础培养基加血清）、细胞基础培养基、PBS，于36℃培养箱过夜培养。

  实验组设置如下：

二、试验结果与分析

  如图2所示，加入1 mL不离心的细胞培养上清液的硫乙醇酸盐流体培养基经培养后，在试管的中上部出现了絮状析出物，加入1200 rpm离心3 min后的上清液、细胞完全培养基（基础培养基加血清）、细胞基础培养基和PBS的硫乙醇酸盐流体培养基经培养后未出现析出物。

图2左图为絮状物的放大图，右图为硫乙醇酸盐流体培养基的培养结果（从左到右分别为加入不离心的细胞培养上清液、离心后上清液、细胞完全培养基、细胞基础培养基（未添加血清）、PBS的硫乙醇酸盐流体培养基）

  仅有加入不离心细胞培养上清液的硫乙醇酸盐流体培养基中出现析出物，而经过1200 rpm离心后的上清液加入硫乙醇酸盐流体培养基则未产生可见的析出物。通过对比两者差别，推测该析出物是细胞培养上清液中的未贴壁细胞、细胞碎片和凋亡小体等物质在硫乙醇酸盐流体培养基中聚集产生。此外，本次试验出现的析出物较少，可能是采用T25瓶培养细胞的上清液中含有的未贴壁的细胞、细胞碎片、凋亡小体等不溶性成分较少导致。

  根据实验结果，一方面，由于硫乙醇酸盐流体培养基中含有一定量的琼脂可以防止液体流动，阻止了不溶物的扩散；另一方面，未离心细胞上清液中可能含有较多的未贴壁细胞、细胞碎片和凋亡小体等不溶性成分，在硫乙醇酸盐流体培养基中的某些成分（如还原剂、金属离子等）的作用下逐渐聚集，是形成絮状析出物的主要原因；因此，离心处理去除不溶性细胞成分后，该现象不再出现，而完全培养基、基础培养基中不含未贴壁细胞、细胞碎片和凋亡小体等不溶性成分，该现象同样无法发生。

三、避免析出物的措施与鉴别方法

  为避免析出物现象产生，需要加入硫乙醇酸盐流体培养基的细胞上清液，可将细胞上清液进行预处理，如：对细胞上清液进行1200 rpm离心3 min到5 min，之后取上清液进行后续实验，避免细胞碎片干扰。同时，建议设置“未离心上清液”的对照，便于区分析出物与微生物污染。

  对于析出物与微生物污染的鉴别方法，首先，可通过外观鉴别，析出物通常出现在试管上部，颜色呈白色/淡黄色，絮状/纱状颗粒析出，振荡后可分散；微生物污染导致的浑浊为均匀浑浊，振荡后无明显沉降，部分可形成菌膜或沉淀；其次，可通过染色镜检鉴别，取含析出物的培养基涂片，革兰氏染色后镜检，析出物无微生物形态（细菌、真菌），仅见无规则颗粒；污染样品可见大量微生物；此外，还可以通过培养鉴别，将可疑样品接种至营养琼脂平板进行培养，析出物样品无菌落生长，污染样品可见明显菌落。

四、结论

  硫乙醇酸盐流体培养基中加入未离心细胞上清液出现的絮状析出物，是未贴壁的细胞、细胞碎片、凋亡小体等不溶性成分与培养基中某些成分发生作用或物理吸附聚集的结果。离心处理可去除不溶性细胞成分，可避免析出物形成。该现象并非微生物污染，但其易干扰检测结果判定，因此，在细胞上清液的硫乙醇酸盐流体培养基无菌检测中，可以执行离心预处理流程，并通过对照实验与染色镜检等方法鉴别析出物与污染。

五、相关产品

  相关产品如下，客户可根据实际情况和用途选用。

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