近岸河流水域微生物检测-延迟培养法

引言

  微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水中常含有一定数量的病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中较为常见且具有重要影响的包括：沙门氏菌属、志贺氏菌属、粪链球菌、肠道病原性大肠埃希氏菌以及肠道病毒等。

  前篇已简述总大肠菌群和粪大肠菌群的检测方法，本文主要介绍总大肠菌群和粪大肠菌群检测中可能会用到的另一种方法，延迟培养法。

  对于其他近岸河流水微生物检测的相关内容可参考《近岸河流水域微生物检测-总大肠菌群的测定多管发酵法》等文章。

一、延迟培养法

  延迟培养法可以允许水样经滤膜过滤后，将滤膜装运、输送到实验室，进行培养并完成检验。

  在测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群时，若在常规的检验步骤不能实现时，例如运输的途中不能保证所要求的温度，或在采样后不能在允许的时间内进行检验等都可应用延迟培养。

  延迟培养试验基本上是依照检验总大肠菌群和粪大肠菌群的滤膜法进行修正而来的。此法是将水样在现场过滤后，将滤膜置于培养基上，然后运到实验室。这种运送滤膜的培养基能在运输过程中保持大肠菌群细菌的活性，但又不允许它们在运输到实验室的途中长成可见的菌落。

  其操作步骤为：在采集水样后，立即进行过滤，将滤膜安放在运输培养基（LES-MF保存性培养基）上，再送到实验室；在实验室将滤膜转移到检测培养基上（总大肠菌群为LES-Endo琼脂培养基，粪大肠菌群为MFC培养基），进行培养及后续检测。下图为大肠菌群及粪大肠菌群分别在两种培养基上的生长特征（图1）。

LES-Endo琼脂培养基	MFC琼脂培养基

图1 大肠菌群及粪大肠菌群在LES-Endo琼脂及MFC琼脂上的菌落特征

二、总大肠菌群的延迟培养法

  总大肠菌群的延迟培养法分为M-远藤氏法和LES法。

1.培养基

  M-远藤氏法培养基

  （1）M-远藤氏培养基HB0138-2M-远藤氏培养基

  （2）M-远腾氏防腐培养基：按M-远腾氏培养基配制，每升再加3.84 g苯甲酸钠。另外，要根据水样情况来决定是否把环己亚胺加到M-远藤氏防腐培养基中。如已发现有蔓生霉菌或真菌的水样，按每100 mLM-远藤氏防腐培养基加入50 mg环已亚胺。

  LES法培养基

  （3）LES MF保存性培养基HB8776LES MF保存性培养基

  （4）LES远藤氏培养基HB0161-1LES远藤氏培养基

2.步骤

（1）采样前的准备

  过滤装置：滤膜和滤器的灭菌见系列前文《总大肠菌群的测定滤膜法》。

  培养皿：无菌的、密封保湿的塑料培养皿，紧急情况下，也可使用无菌的玻璃培养皿，但要用密封膜进行包装。

（2）水样的保存和运输

  用灭菌镊子把一片灭菌吸收垫放在一个灭菌的培养皿底部，并吸收足够的、已选择好的，在运输过程中可抑制大肠杆菌生长的运输培养基（如M-远藤氏防腐培养基或LES-MF保存性培养基），使垫片浸湿饱和（小心地吸去剩余培养基）。

  用灭菌镊子从过滤设备上取下滤膜（要求同滤膜法），放在已用运输培养基饱和过的吸收垫上。紧闭塑料培养皿就能保持高湿度，防止滤膜损失水分。注意运输途中不使滤膜脱水，但也不要使皿中有过多的液体。把放置有滤膜的培养皿放在适当的容器里送到实验室去做试验。运输时，样品可在此种培养基上保持72 h而无明显生长。这种运输培养基可邮递或普通方法运送。当遇到高温时，偶然能在运输培养基上发现有菌落生长。

（3）转移和培养

  在实验室里，以无菌操作把滤膜从运输用的塑料培养基皿上移到含有M-远藤氏培养基或LES-远藤氏琼脂培养基的第二个无菌的平血中。

  M-远藤氏法：从M-远藤氏防腐培养基上把滤膜转移到含有没有抑菌剂的M-远藤氏培养基的吸收垫平皿中，在37℃±1℃培养20 h~22 h。

  LES法：把滤膜从LES-MF保存性培养基转移到LES-远藤氏琼脂培养基里，在37℃±1℃培养20 h~22 h。在转移时，如果不用放大镜已可观察到清晰的菌落，则在放进37℃±1℃的温度培养16 h~18 h之前，将含有转移滤膜的培养皿先存放在5℃~10℃处。缩短培养时间是为检验员提供一种控制细菌生长过度或菌落光泽消散的办法，以免影响对大肠菌群的菌落计数。

3.总大肠菌群数的估算

  结果与报告方式同系列前文《总大肠菌群的测定滤膜法》。

  计数滤膜上生长的大肠菌群菌落总数，根据过滤的水样量计算1 L水样中总大肠菌群。

  滤膜上菌落数以20 CFU-60 CFU/片较为适宜。

三、粪大肠菌群的延迟培养法

  粪大肠杆菌的延迟培养步骤类似总大肠菌群的延迟培养。只有在不能对粪大肠杆菌进行滤膜试验时，才可使用延迟培养。其操作步骤为：在野外现场采集水样后，立即进行过滤，将滤膜安放在运输培养基上，再送到实验室；在实验室将滤膜转移到MFC培养基上，于44.5℃培养24 h±2 h，对粪大肠菌群菌落计数。

1.培养基

  （1）LES MF保存性培养基HB8776LES MF保存性培养基

  （2）MFC肉汤HB0154-1MFC肉汤

  （3）MFC琼脂HB0154MFC琼脂

2.步骤

  （1）采样前的准备：采样前的准备同本文第二章的2（1）

  （2）样品的保存和运送：方法及注意事项同本文第二章的2（2）

  （3）转移：在实验室内，从保存培养基内取出滤膜，放置到另一个含有MFC培养基（吸足液态培养基的吸收垫或琼脂培养基）的培养皿中。

  （4）培养：将培养皿放置在防水的塑料袋或容器内，浸没在44.5℃±0.5℃的恒温水浴中，培养24 h。

3.计算及报告结果

  粪大肠菌群菌落在MFC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在MFC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。必要时可将可疑菌落接种于EC培养液，44.5℃±0.5℃培养24 h±2 h，如产气则证实为粪大肠菌群。

  计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每1 L水样中的粪大肠菌群数。

四、相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有延迟培养试验所使用运输培养基及检测培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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