高糖类培养基美拉德反应的影响因素研究（上）

一、引言

  美拉德反应（Maillard Reaction）是还原糖与氨基酸、蛋白质在加热或长期储存条件下发生的非酶促褐变反应，该反应无需酶参与，仅由温度、反应时间、物料接触状态等因素调控。反应过程中不仅会生成棕黑色类黑素色素，导致体系褐变，还会消耗培养基中的还原糖、氨基酸等关键营养成分，甚至产生对微生物生长不利的副产物。沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）与MRS培养基均为微生物培养中常用的高糖类培养基，前者广泛应用于真菌培养，后者适用于乳酸菌增殖，二者的营养成分完整性直接影响菌种的生长速率、菌落形态及检测准确性。《GB 4789.28-2024》中SDA与MRS的制备方式为加热溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min备用。在实际制备过程中，灭菌作为核心环节，其设备选型、参数设置及后续处理方式常导致培养基褐变程度差异，进而影响使用效果。目前关于灭菌相关条件对高糖类培养基美拉德反应的系统研究较少，因此本试验通过设置多组变量，探究不同条件对SDA和MRS培养基褐变的影响，明确美拉德反应的关键影响因素，为培养基标准化制备提供理论依据与技术支撑。

二、试验与结论

1.不同灭菌锅灭菌试验

  （1）控制条件：121℃、15 min灭菌，灭菌后立即取出。

  （2）变量条件：小灭菌锅（6号锅，容积5L）处理100 mL、200 mL培养基，大规格压力蒸汽灭菌锅（容积50L）处理200 mL、400 mL培养基。

  （3）结论

  由图1~图6可知，两种培养基灭菌前均呈浅黄色（图1、图4），无褐变现象。经小灭菌锅处理的100 mL、200 mL SDA及MRS培养基，褐变程度较轻，呈浅棕色；而大灭菌锅处理的200 mL、400 mL培养基，褐变明显加剧，呈棕色（图2、图5）。倾入平皿后，该差异更为直观（图3、图6），且400 mL大灭菌锅处理组褐变程度高于200 mL大灭菌锅组。这表明灭菌锅规格及处理体积对美拉德反应有显著影响，大灭菌锅容积大，散热速率慢，培养基在高温环境中停留时间间接延长，导致美拉德反应更充分。

经回收率试验测定，SDA与MRS两种培养基经不同规格灭菌锅（小灭菌锅、大灭菌锅）灭菌处理后，其回收率无显著差异。

图1 SDA灭菌前颜色

图2 SDA小锅灭菌后颜色（100mL、200mL-1）和大锅灭菌后颜色（200mL-2、400mL）

图3 倾入平皿后颜色

图4 MRS灭菌前颜色

图5 MRS小锅灭菌后颜色（100mL、200mL-1）和大锅灭菌后颜色（200mL-2、400mL）

图6 倾入平皿后颜色

2.不同冷却方式试验

  （1）控制条件：配制200 mL培养基，121℃、15 min灭菌，灭菌后立即取出。

  （2）变量条件：自然冷却（室温静置冷却至55℃）、快速冷却（置于冰水浴冷却至55℃）。

  （3）结论

  SDA培养基经自然冷却和快速冷却后，均未出现明显褐变差异（图7）。但MRS自然冷却组呈浅棕色，快速冷却组颜色略深，为棕色。倾入无菌平皿中观察，SDA、MRS褐变等级无本质区别（图9）。这说明冷却速率对美拉德反应的影响较小，可能是因为冷却阶段培养基温度已脱离美拉德反应的最适温度范围（通常为100~150℃），反应速率显著降低，因此两种冷却方式下褐变程度差异不显著。

  经回收率试验测定，SDA与MRS两种培养基灭菌后经不同冷却方式处理，其回收率无显著差异。

图7 SDA灭菌后自然冷却（左）和快速冷却（右）

图8 MRS灭菌后自然冷却（左）和快速冷却（右）

图9 倾入平皿后颜色

3.灭菌后取出时间试验

  （1）控制条件：配制200 mL培养基，121℃、15 min灭菌。

  （2）变量条件：灭菌程序结束后，分别在锅内温度降至95℃时取出、降至70℃时取出。

  （3）结论

  灭菌后95℃取出的SDA和MRS培养基，颜色为浅黄色和浅棕色，褐变程度极轻；而70℃取出的培养基，颜色明显加深为浅棕色至棕色（图10、图11），倾入平皿后差异依然显著（图12）。这一结果表明，灭菌后延时取出（低温取出）会加剧美拉德反应，原因是培养基在灭菌锅内温度从121℃降至70℃的过程中，经历了更长时间的中高温阶段，为还原糖与氨基酸的反应提供了充足时间，导致类黑素积累增加。

  回收率试验结果显示，SDA与MRS两种培养基经121℃、15 min灭菌后，在目标菌数≥100 CFU的条件下，70℃取出组的培养基回收率仅为95℃取出组的50%。

图10 SDA灭菌后95℃拿出（左）和70℃拿出（右）

图11 MRS灭菌后95℃拿出（左）和70℃拿出（右）

图12 SDA（上）和MRS（下）倾入平皿后颜色

三、总结

  美拉德反应的本质是还原糖与氨基化合物的缩合、重排、裂解及聚合反应，温度、反应时间、物料接触状态是调控该反应的核心因素。本研究中，大灭菌锅处理导致的褐变加剧，本质是高温累积效应；灭菌后70℃取出与延长灭菌时间的作用机制相似，均通过增加中高温阶段的持续时间，促进类黑素生成。而灭菌前晃匀处理则通过优化物料分散状态，降低局部反应浓度，从而抑制褐变，这与张莉等关于物料混合均匀度对美拉德反应影响的研究结果一致。

  SDA与MRS培养基的褐变差异，可能与二者的营养成分组成有关。MRS培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物等多种高蛋白成分，氨基酸种类更丰富，与还原糖的反应位点更多，因此对试验条件更敏感，褐变程度整体高于SDA培养基。

  在微生物培养中，美拉德反应不仅导致培养基褐变，还会消耗葡萄糖、氨基酸等营养物质，降低培养基的营养供给能力，同时类黑素可能对部分菌种（如乳酸菌、酵母菌）的生长产生抑制作用。因此，结合本研究结果，实际制备高糖类培养基时，建议采用小规格灭菌锅处理小体积培养基，并采用自然冷却方式，以最大程度抑制美拉德反应，保障培养基的营养品质与使用效果。

四、产品展示

  试验中培养基均为我公司产品，客户可根据实际应用情况和用途进行选用。

表1 部分产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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