利用酶消化法制备脐带间充质干细胞并收集外泌体

间充质干细胞（MSCs）起源于中胚层，可从骨髓、脂肪、脐带、胎盘等多种组织中分离获得，具备贴壁生长、自我更新、成骨/成脂/成软骨三系定向分化及免疫调控等生物学特性。脐带间充质干细胞可大量分泌外泌体，外泌体携带蛋白质、mRNA、microRNA等活性物质，具备低免疫原性、易储存、给药安全等优势，在组织修复、抗炎、皮肤再生等领域应用前景广阔。

传统组织块贴壁法存在细胞爬出周期长、收获细胞总量有限等短板，而酶消化法利用胶原酶充分解离华通氏胶组织，可快速获得大量单细胞，缩短原代培养周期，适合大批量种子细胞制备，以下将简单介绍标准化酶消化制备脐带间充质干细胞以及收集其外泌体的流程。

一、脐带间充质干细胞的酶消化分离制备

（一）脐带组织预处理

1、无菌条件下将新鲜脐带置于无菌培养皿中，加入含双抗PBS浸泡冲洗3次，每次5 min，彻底冲洗表面残留血液与杂质，直到整个组织块变白；

2、剔除脐带表面筋膜及多余组织，将脐带剪切成2 cm左右小段，沿脐静脉纵向剖开组织；

3、仔细剥离剔除1条脐静脉与2条脐动脉，充分暴露脐带内部凝胶状华通氏胶组织；

4、用无菌眼科剪将剥离的华通氏胶剪切成约2 mm³~3 mm³碎块，PBS充分漂洗去除血细胞，除去液体备用。

（二）酶消化法原代细胞分离

1、消化液配制：采用0.2%的Ⅰ型胶原酶消化工作液，以无血清基础培养基稀释，现配现用；

2、组织消化：将华通氏胶碎块转移至50 mL无菌离心管，加入2倍体积胶原酶消化液，密封后置于37℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中孵育45 min~2 h，期间可轻柔晃动混匀几次，观察组织块完全松散消散；

3、终止消化：消化完成后，加入等体积含10%FBS和双抗的DMEM完全培养基中和胶原酶活性，终止消化反应；

4、离心除杂：离心收集细胞。用新培养液悬浮细胞，接种于细胞培养瓶或培养皿，于37℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中培养。

6、换液培养：观察细胞贴壁情况，待培养48 h更换完全DMEM培养基溶液，彻底去除未贴壁杂细胞；以后每2 d~3 d更换1次新鲜完全培养基，细胞贴壁融合后传代培养。

二、细胞传代与扩增培养

1、传代时机：严格控制细胞融合度在80%~90%，避免细胞过度汇合导致接触抑制、老化及分化；

2、消化处理：弃去旧培养基，用无钙镁无菌PBS清洗细胞表面1次；加入预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育3 min~5 min，显微镜下观察细胞皱缩变圆；

3、终止与制备悬液：加入等量完全培养基终止消化，轻柔吹打培养瓶底壁，使细胞分散为单细胞悬液；

4、离心接种：将细胞悬液转移至离心管，1000 g~1200 g离心5 min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞；调整接种密度为5000 cell/cm²~6000 cell/cm²，接种至新培养瓶；

5、常规扩增：置于培养箱中常规培养，每2 d～3 d换液一次，按1:2比例持续传代扩增；若细胞生长缓慢，可添加EGF、FGF2等细胞因子，促进干细胞增殖并维持干性。

三、外泌体分泌诱导前期细胞准备

1、选取P3~P5代状态优良的脐带间充质干细胞，常规消化、接种于T75/T175培养瓶，使用常规完全培养基扩增培养至T175/多层细胞培养器；

2、待细胞融合度达到70%~80%时，弃去瓶内全部培养基，用无菌无钙镁PBS充分洗涤细胞3次，彻底清除血清残留、外源囊泡杂质，避免干扰后续外泌体纯度；

3、逐步更换为无外泌体专用无血清培养基（无动物源、无外源囊泡、无酚红），培养基添加适量EGF、FGF2促分泌细胞因子，刺激脐带间充质干细胞提升外泌体分泌量；

4、置于37℃、5%的CO₂培养箱中静置培养48 h，期间不换液。

四、细胞培养上清收集与预处理

1、培养结束后，无菌吸取全部细胞上清，转移至无菌50 mL离心管，全程无菌操作；

2、梯度低速离心逐级去除细胞、细胞碎片、凋亡小体，离心条件为4℃：

①300 g离心10 min，去除悬浮完整细胞；

②2000 g离心10 min，去除大片细胞碎片和死亡细胞；

③10000 g离心30 min，去除微囊泡、凋亡小体等细胞碎片；

3、小心吸取中层澄清上清，避开底部沉淀，经0.22 μm无菌过滤，彻底截留大颗粒杂质，滤液暂存4℃备用，2 h内完成超速离心纯化。

五、超速离心法纯化外泌体

1、将过滤后的上清转移至超速离心专用薄壁离心管，严格配平；

2、4℃、100000 g超速离心70 min，离心结束后缓慢取出离心管，轻柔弃净全部上清，管底白色沉淀即为粗外泌体；

3、加入预冷无菌PBS重悬管底沉淀，再次4℃、100000 g超速离心70 min，轻柔弃净全部上清，去除可溶性杂蛋白，提升外泌体纯度；

4、少量无菌PBS重悬最终沉淀，得到高纯度脐带间充质干细胞来源的外泌体（HucMSCExo）原液，分装至无菌离心管。

六、外泌体保存与基础鉴定

1、短期保存（1个月内）：分装后置于-80℃超低温冰箱避光冻存，避免反复冻融；长期保存可添加专用外泌体保护剂，液氮长期储存。

2、基础鉴定检测：透射电镜（TEM）：外泌体呈典型茶托状双层膜囊泡，粒径30 nm~150 nm；NTA纳米颗粒跟踪分析：粒径主峰集中100 nm左右，粒径分布均匀；Western blot标志物检测：外泌体特异性标志物CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101等高表达，阴性标志物Calnexin几乎无表达。

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