近岸河流水域微生物检测-总集篇

引言

微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水及受污染水体中常含有大量病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中影响较大、检出率较高的主要包括，总大肠菌群、粪大肠菌群、沙门氏菌属、粪链球菌等。

前文已分别就上述指标的单项测定方法进行阐述，涵盖多管发酵法、滤膜法、延迟培养法、选择性增菌与生化鉴定等技术。本文将在此基础上，整理上述各菌群的检测原理、操作流程、关键培养基及结果判读要点。

对于其他近岸河流水微生物检测的相关内容可参考《近岸河流水域微生物检测-粪大肠菌群的测定》、《近岸河流水域微生物检测-总大肠菌群的测定滤膜法》、《近岸河流水域微生物检测-粪链球菌测定滤膜法与倾注平板培养法》、《近岸河流水域微生物检测-沙门氏菌属的测定》等文章。

一、总大肠菌群的测定

总大肠菌群是指在37℃培养条件下，48小时内能够发酵乳糖、产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。因其在粪便中数量大、在水体中存活时间长，常作为水体受粪便污染的指示菌。

（一）多管发酵法

多管发酵法适用于各类水样，包括浑浊水、工业废水、生活污水及底泥样品，是大肠菌群检测的经典方法。

1.培养基

乳糖蛋白胨培养液（HB0119），用于初发酵试验，内含乳糖、蛋白胨及溴甲酚紫指示剂，可观察产酸产气情况；品红亚硫酸钠培养基（HB0118），选择性平板培养基，大肠菌群菌落呈紫红色、带金属光泽；伊红美蓝琼脂（HB0107），弱选择性培养基，典型大肠菌群菌落呈深紫黑色、具金属光泽。

2.操作步骤

初发酵试验，根据水样污染程度，选择10 mL、1 mL、0.1 mL三个梯度水样，分别接种于含乳糖蛋白胨培养液的试管中，37℃培养24 h±2 h。产酸、产气判为阳性。

图1 只产酸及产酸产气的发酵管特征（左2为只产酸，右2为产酸产气）

平板分离，将初发酵阳性管培养物划线接种于品红亚硫酸钠琼脂或伊红美蓝琼脂平板，37℃培养18 h~24 h。

图2 大肠菌群在品红亚硫酸钠培养基上的特征

图3 大肠菌群在伊红美蓝培养基上的特征

镜检与复发酵，选取典型菌落进行革兰氏染色镜检，革兰氏阴性、无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，37℃培养24 h，产酸产气证实为总大肠菌群阳性。3.结果计算

查MPN表，计算每1 L水样中总大肠菌群数量。

（二）滤膜法

滤膜法适用于较清洁、浊度较低的地表水、饮用水、水源水，操作简便、计数直观、重复性好。

1.培养基

品红亚硫酸钠培养基（HB0118），滤膜贴附培养用；乳糖蛋白胨半固体培养基（HB8463），用于可疑菌落产气确认。

图4 不同细菌在乳糖蛋白胨半固体培养基上的生长特征

2.操作步骤

水样过滤，取适量水样经0.45 μm无菌滤膜过滤，细菌被截留在滤膜表面。培养，将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基表面，37℃培养24 h。计数，选取紫红色、具金属光泽菌落计数，必要时镜检及复发酵确认。

3.结果计算

总大肠菌群数（CFU/L）=（滤膜菌落数×1000）÷过滤水样体积（mL）。

滤膜适宜计数范围，20 CFU~60 CFU/片。

（三）延迟培养法

延迟培养法适用于采样后无法及时送检、运输温度不可控、现场无培养条件的情况，可将滤膜在保存培养基上运输，最长可保存72 h。

1.培养基

LES MF保存性培养基（HB8776），运输保存用，维持菌活性、抑制菌落生长；M-远藤氏防腐培养基，含苯甲酸钠，用于运输抑菌；LES远藤氏培养基（HB0161-1）、M-远藤氏培养基（HB0138-2），实验室检测计数用。

2.操作步骤

现场过滤，水样经无菌滤膜过滤，将滤膜置于运输培养基上。运输保存，密封培养皿，常温运输，72 h内送至实验室。转种培养，将滤膜转移至LES远藤氏或M-远藤氏培养基，37℃培养20 h~22 h，计数典型菌落。

图5 大肠菌群在LES-Endo琼脂上的菌落特征

二、粪大肠菌群的测定

粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，特指44.5℃条件下能生长、发酵乳糖产酸产气的菌群，主要来源于人和温血动物粪便，对粪便污染的指示更具特异性。

（一）多管发酵法

1.培养基

乳糖蛋白胨培养液（HB0119），37℃初发酵；EC肉汤（HB0105），44.5℃复发酵，产气为阳性。

2.操作步骤

初发酵，同总大肠菌群，37℃培养24 h。复发酵，将阳性管接种EC肉汤，44.5℃±0.5℃培养24 h±2 h，产气判为粪大肠菌群阳性。

（二）滤膜法

1.培养基

MFC琼脂（HB0154），选择性培养基，44.5℃培养，粪大肠菌群菌落呈蓝色或蓝绿色。

2.操作步骤

水样过滤，取适宜体积水样过滤。培养，滤膜贴于MFC琼脂，44.5℃培养24 h±2 h。计数，统计蓝色/蓝绿色菌落，计算菌数。

图6 粪大肠菌群在MFC琼脂培养基上的菌落特征

（三）延迟培养法

1.培养基

LES MF保存性培养基（HB8776），运输保存；MFC琼脂（HB0154），实验室检测。

2.操作步骤

现场过滤→运输培养基保存→实验室转种MFC琼脂→44.5℃培养、计数。

三、沙门氏菌属的测定

沙门氏菌是重要肠道致病菌，来源于人畜粪便，可引发食物中毒及肠道传染病。水中含量通常较低，需经浓缩、增菌、选择性培养、生化及血清学鉴定。

1.增菌及选择性培养基

缓冲蛋白胨水（BPW，HB4084），37℃培养16 h~20 h，修复受损菌、促进复苏，用于前增菌；

四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB，HB4086-10），43℃培养22 h/44 h，适合低浓度、受损沙门氏菌；

氯化镁-孔雀绿增菌液（RVS，HB4198-25），37℃培养22 h，适合高浓度沙门氏菌；

双倍浓度亚硒酸盐SF培养液，37℃培养24 h，用于伤寒沙门氏菌检测；

酚红煌绿琼脂（HB8396），37℃培养24 h，菌落呈粉红色；

亚硫酸铋琼脂（BS，HB4090-6），37℃培养24 h/48 h，菌落灰黑色、带金属光泽，培养基变黑。

图7 沙门氏菌在酚红煌绿平板和亚硫酸铋平板上的生长特征

2.生化鉴定培养基

营养琼脂（NA，HB0109），菌落纯化；

三糖铁琼脂（TSI，HB4088-13），典型沙门氏菌反应，斜面碱性、底层酸性、产气、产硫化氢；

脲酶、苯丙氨酸脱氨、吲哚、赖氨酸脱羧、β-半乳糖苷酶等生化培养基。

表1 沙门氏菌鉴定项目及结果对照表

*伤寒沙门氏菌不产气，不形成H₂S。

**沙门氏菌Ⅲ亚属（亚利桑那菌）乳糖和β-半乳糖苷酶试验为阳性，Ⅱ亚属乳糖为阴性而β-半乳糖苷酶试验为阳性。

3.操作步骤

图8 沙门氏菌检验流程图

四、粪链球菌的测定

粪链球菌为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性短链球菌，属Lancefield D族，可作为粪便污染指示菌，通过粪大肠菌群/粪链球菌比值（FC/FS）判断污染来源。

（一）多管发酵法

适用于浑浊、含重金属、杂菌多的水样。

1.培养基

叠氮钠葡萄糖肉汤（HB0266），推测试验，37℃培养24 h~48 h，浑浊为阳性；乙基紫叠氮钠肉汤（HB0267），证实试验，37℃培养24 h，管底紫色沉淀或浑浊为阳性。

图9 粪链球菌在叠氮钠葡萄糖肉汤的阳性结果

图10 粪链球菌在乙基紫叠氮钠肉汤的阳性结果

2.操作步骤类似文章前述内容。

（二）滤膜法

适用于低菌量水样。

1.培养基

KF链球菌琼脂（HB0268-4），37℃培养48 h，菌落呈红色/粉红色；胆汁-七叶苷-叠氮化物琼脂（HB0133-5），44℃培养48 h，菌落周围褐色至黑色为阳性。

图11 粪链球菌在胆汁七叶苷叠氮钠琼脂的结果

2.操作步骤类似文章前述内容

（三）倾注平板法

适用于高浊度、氯消毒后水样。

1.培养基

KF链球菌琼脂（HB0268-4），水样与融化培养基混匀、凝固后，37℃培养48 h，计数红色菌落。

2.操作步骤类似文章前述内容

五、相关培养基采购信息

青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供上述所有检测所需培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

上一篇：食品菌落总数高就是不安全吗

下一篇：没有了！