冻干菌种乙型溶血性链球菌的活化全攻略

一、开篇小科普

1、冷冻干燥保藏法，菌种的“休眠冷冻仓”

做微生物实验的小伙伴都知道，菌种反复传代极易退化、丢特性，斜面冷藏撑不过半个月，长期保存全靠冷冻干燥保藏法（业内简称冻干法），也是国家级菌种库常使用的标准保藏技术。它的原理超有意思，利用水的升华物理特性，在真空、低温环境下，菌体内部冻结形成的固态冰，不经过液态水，直接升华为水蒸气，被冻干机冷阱捕捉移除。在低温冻结过程中，避免胞内水分形成大冰晶刺破细胞膜；真空升华时，脱除游离水与大部分结合水，最终使菌体处于极低水分的休眠状态，细胞代谢几乎完全停止，菌体遗传性状稳定，极少发生变异。微生物经过冷冻干燥处理后，4℃保存5～10年，-20℃条件下可保存15～20年，且菌种性状稳定，传代变异少，优于斜面传代保藏，是微生物菌种长期保藏的主流标准技术。

2、乙型溶血性链球菌，难伺候的“娇气苛养菌”

今天咱们的主角——乙型溶血性链球菌（Streptococcus pyogenes），妥妥的实验圈“难养大户”。它是链球菌属中的一种，具有致病性强的特点，可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行。在菌落周围形成一个宽2 mm~4 mm、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。

乙型溶血性链球菌最让人头疼的一点，标准苛养菌，嘴刁得很！对营养要求相对较高，普通营养琼脂根本喂不饱，生长微弱，使用哥伦比亚血琼脂/5%脱纤维羊血琼脂进行培养，才能生长良好。

二、三步轻松活化冻干菌种，3种方法按需挑选

1、试验耗材提前备齐，开工不慌乱

冻干乙型溶血性链球菌菌种、固体培养基（TSA平板、血平皿）、接种环、移液枪+枪头、酒精灯、镊子。

2、开瓶复溶，轻柔操作不“伤菌”

西林瓶顺着铝盖箭头撕掉塑盖，镊子过火灭菌放凉后打开胶塞，全程靠近酒精灯火焰，杜绝杂菌污染；复苏液TSB安瓿找准瓶颈蓝点易折处掰开，移液枪吸取全部复苏液打入西林瓶；无菌枪头反复轻柔吹打，把底部紧实的冻干粉完全打散，均匀制成菌悬液。

3、三套活化和培养方案，新手老手都能用

这株菌娇气不耐造，单一种方法容易活化失败，推荐三套方案按需选用。

（1）划线法：接种环蘸取一环菌液在TSA和血平皿上三区划线（关于如何在平板上划线，可参考最基础的平板划线  最漂亮的三区 努力划出尽量多的单菌落！）。

（2）涂布法：吸取100 μL菌液在TSA和血平皿上均匀地滴加，然后旋转倾斜平板，使液滴较均匀地铺开，也可以使用接种环将菌液划开。不建议使用涂布棒，避免烫死菌体或吸附带走菌体（关于如何正确涂布，可参考操作视频 | 涂布平板法-实验操作视频-青岛海博生物 (hopebiol.com)）。

（3）继续培养法：复溶后的西林瓶不用倒掉，直接放进36℃±1℃培养箱静置24 h增菌。菌液浓度翻倍后再划线平板，菌落数量远多于前两种方法，活化成功率直接翻倍！

三、结果观察

1、若菌株通过划线法生长良好，可以使用该平板进行菌种使用及保存。

图1 直接划线法菌株24 h生长情况

2、若菌株通过涂布法生长良好，可以使用该平板进行菌种使用及保存。

图2 涂布法菌株24 h生长情况

3、菌株在加入复苏液TSB的西林瓶中继续过夜生长，可以促进其增殖，因此平板上会有更多菌落生长，如图3所示。

图3 继续培养法菌株24 h生长情况

4、无论采取何种活化方法，24 h培养时间内，乙型溶血性链球菌在TSA平板生长状态不如血平皿生长好，这主要原因为血平皿添加了一定量的羊血，营养较为丰富，因此更适合苛养菌类生长，如图1、图2和图3所示。如果没有血平皿，可将TSA平板的培养时间由24 h延长至48 h，促进菌落生长，如图4所示。

图4 菌株在不同时间段的生长情况

四、90%实验人踩过的坑，超全注意事项

1、冻干菌种一次性消耗，开瓶即失效！开封后无法长期存放，剩余菌液直接处理；未拆封的冻干管，长期存放建议-20℃～-80℃避光保存。

2、菌种活化用培养基尽量使用营养型培养基，不要使用选择性培养基。

3、制备血平皿时，需要添加适量比例的脱纤维羊血，但初次制备时容易失败，可参考血平皿制备避坑指南-实验操作视频-青岛海博生物 (hopebiol.com)。

五、产品展示

我公司有乙型溶血性链球菌菌种、活化、增菌培养等相关培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用，如表1所示。

表1 乙型溶血性链球菌相关产品信息汇总

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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