近岸河流水域微生物检测-水中菌落总数的测定

引言

微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水及受污染水体中常含有大量病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中影响较大、检出率较高的主要包括，总大肠菌群、粪大肠菌群、沙门氏菌属、粪链球菌等。

前文已分别就上述指标的单项测定方法进行阐述，涵盖多管发酵法、滤膜法、延迟培养法、选择性增菌与生化鉴定等技术。本文将对水中菌落总数的测定进行介绍。

对于其他近岸河流水微生物检测的相关内容可参考《近岸河流水域微生物检测-粪大肠菌群的测定》、《近岸河流水域微生物检测-总大肠菌群的测定滤膜法》、《近岸河流水域微生物检测-粪链球菌测定滤膜法与倾注平板培养法》、《近岸河流水域微生物检测-沙门氏菌属的测定》等文章。

一、细菌总数测定

细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存在的活细菌的总数。实际上是指1 mL水样在营养琼脂培养基中，于36℃培养24 h后，所生长细菌菌落的总数。此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。

二、水样的稀释

1.选择稀释度

稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30 CFU-300 CFU之间。例如，如果认为直接水样的标准平皿计数可高达3000 CFU，就应该将水样稀释到1:100后，再进行平皿计数。大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1 mL，所得的菌落总数可适于计数。

2.水样的稀释方法

①将水样用力振摇20~25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。

②以无菌操作方法吸取10 mL充分混匀的水样，注入盛有90 mL灭菌水的三角烧瓶中（可放有适量的玻璃珠）混匀成1:10稀释液。

③吸取1:10的稀释液l mL注入盛9 mL灭菌水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管或移液器枪头。

三、水样检测

1.营养琼脂倾注法

①以无菌操作方法用1 mL灭菌吸管或移液器吸取充分混匀的水样或2~3个适宜浓度的稀释水样1 mL，注入灭菌平皿中，倾注约15 mL已融化并冷却到46℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注两个平皿，每次检验时，另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。

②待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃恒温箱内培养24 h，进行菌落计数。

③培养基

营养琼脂培养基（HB0109营养琼脂）

图1 常见菌种在营养琼脂培养基上的形态

2.测试片法

①菌落总数测试片为完全即用型培养基产品，其营养成分为胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖等，符合GB 4789.2标准对测试片的要求。为了更好的进行菌落计数和判读，培养基中添加了TTC显色剂。本产品采用直径为7 cm的培养板，接近直径9 cm的培养皿，方便菌落观察和计数。

②使用测试片前，需平衡至室温。缓慢揭开测试片上层膜，选取合适稀释度的水样稀释液，将1 mL稀释液垂直滴加在测试片中心区域。缓慢盖上上膜，尽量避免气泡的产生，样液会自动均匀扩散。每次检验时，用空白稀释液滴加在另一个测试片上作空白对照。

③菌落总数测试片（RTCSP001菌落总数7cm测试片(AC)）

图2 常见菌种在菌落总数测试片上的形态

四、菌落计数

培养之后，立即进行菌落计数。如果计数必须暂缓进行，需存放于2~8℃冰箱内，不得超过24 h。

作菌落计数时，可用菌落计数器或放大镜检查，以防遗漏，在记下各平皿或测试片的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数。在求同稀释度的平均数时，如果其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。

对那些看起来相似，距离相近但却不相触的菌落，只要菌落之间的距离不小于最小菌落的直径，便应予以计数。那些紧密接触而外观（例如形态或颜色）相异的菌落，也应该予以数。

五、计算和报告计数结果

细菌总数是以每个平皿或测试片菌落的总数或平均数乘以稀释倍数而得来的。各种不同情况的计算方法如下:

1.首先选择平均菌落数在30~300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告（表1例1）。

2.若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300之间，则应按二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两名的平均数，若大于2则报告其中较小的数值（表18例2、例3）。

3.若所有的稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1例4）。

4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1例5）。

5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘稀释倍数报告（表1例6）。

表1 不同菌落数的对应报告方式

6.菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，用10的指数来表示。在报告菌落数为“多不可计”时，应注明水样的稀释度。

六、相关培养基的采购

青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有上述所需产品，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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