微生物厌氧培养中培养基的除氧技术

氧气是抑制厌氧菌生长繁殖的关键因子，绝大多数严格厌氧菌暴露于微量氧气环境下就会发生氧化损伤，酶系统失活，最终无法正常增殖。在厌氧微生物分离、纯化与扩大培养实验中，培养基内溶解氧的去除程度，直接决定厌氧培养实验的成败。

严格厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶类，无法分解环境中的活性氧自由基。配制完成的液体培养基在常温静置时会不断吸收空气中的氧气，溶解氧浓度可达到6 mg/L～8 mg/L。即便后续置于厌氧培养箱内培养，残留在培养基内部的溶解氧依然会持续毒害菌体。因此，培养基在分装、灭菌、接种之前，必须预先完成除氧处理。常规厌氧实验包含两级除氧：第一级是在培养基配制阶段去除溶解氧，第二级是在培养容器内隔绝气相氧气。目前实验室常用的物理除氧法操作简便、成本低廉，化学除氧法除氧彻底，两种手段经常联合使用，大幅降低培养基含氧量。

一、物理除氧方法

物理除氧依靠温度变化、惰性气体置换等物理手段，降低氧气在水溶液中的溶解度，将溶解氧从液体中驱赶出来，不改变培养基营养成分，不会引入杂质，是基础厌氧实验首选方案。

1、煮沸驱氧法

原理是气体在水中的溶解度随温度升高而下降，常压下将培养基加热至沸腾，水体剧烈汽化，水蒸气气泡会携带溶解氧逸散到空气中。煮沸时间越长，除氧效果越显著。

具体操作步骤主要为将配制好的液体培养基放在电热炉上持续加热，保持微沸状态15 min～30 min。加热过程中不断搅拌，防止局部暴沸与营养成分焦化。煮沸结束后，立刻用橡胶塞封住容器瓶口，减少空气再次溶入。待培养基温度降至60℃以下再进行高压蒸汽灭菌。

该方法无需额外试剂，适用于普通梭菌、双歧杆菌等兼性厌氧与中度厌氧菌培养。但是缺点也十分明显，冷却过程中培养基会重新接触空气，再次复氧，无法达到严格厌氧条件；长时间高温煮沸会破坏葡萄糖、维生素等热敏性营养物质，造成培养基营养损耗。仅适合对厌氧条件要求不高的常规菌种培养。

2、惰性气体连续吹扫法

原理是向培养基底部持续通入不含氧气的惰性气体，利用气泡搅动液体，将溶解氧不断带出液面。工业与实验室最常用氮气，高纯氮气含氧量低于10 ppm，部分高标准实验会选用氩气。

操作流程为在培养基三角瓶橡胶塞上打孔，插入玻璃通气管，导管末端伸至瓶底。打开高纯氮气钢瓶阀门，调节气流为细小连续气泡，持续向液体培养基通气30 min～60 min。通气全程保持培养基处于温热状态，进一步降低氧气溶解度。通气完成后，迅速密封瓶口，立刻高压灭菌，灭菌结束后隔绝空气自然冷却。对于分装到试管、血清瓶中的培养基，可以分装完成后再逐个通氮气吹扫。

氮气吹扫可以把溶解氧降到极低水平，除氧效果远优于单纯煮沸，能够满足破伤风梭菌、产气荚膜梭菌等严格厌氧菌的培养需求。整个过程不添加化学物质，培养基组分稳定。不足之处在于需要配备氮气钢瓶、减压阀与管路，设备成本较高；操作耗时较长，大批量培养基处理效率较低；如果密封不及时，冷却阶段依然会少量复氧。

3、真空脱气法

密闭容器内形成负压真空环境，液体内部溶解的气体会析出形成气泡，从而脱去溶解氧。多次反复抽真空—恢复常压，可以逐步去除大部分溶解气体。

操作方式为将培养基装入可耐压的血清瓶，预留少量顶空，连接真空泵进行抽真空处理，保持负压5 min后缓慢通入少量氮气平衡压力，重复3～5个循环。真空脱气常与水浴加热配合使用，温热培养基脱气效率更高。

优点是脱气速度快，适合粘稠度较高的半固体培养基，避免长时间煮沸造成琼脂老化。但普通玻璃容器不耐负压，容易发生炸裂，必须使用耐压密封瓶；反复抽真空容易造成挥发性有机酸、醇类营养物质挥发流失，因此不适用于含有挥发性底物的培养基。

二、化学除氧法

物理方法只能去除大部分溶解氧，冷却分装时总会有少量氧气重新溶解。在培养基中添加还原性化学试剂，可以消耗残留微量氧气，构建还原性厌氧环境，是严格厌氧培养必不可少的手段。

1、还原剂添加法

实验室最经典的三类还原剂：巯基乙酸、L-半胱氨酸盐酸盐、连二亚硫酸钠。

半胱氨酸盐酸盐的使用浓度为0.05%～0.1%，还原性温和，高温灭菌稳定性强，大多数厌氧菌培养基首选还原剂。它可以消耗微量氧气，同时维持培养基较低的氧化还原电势。通常在培养基煮沸除氧后，温度降到60℃时加入，避免高温氧化失效。

巯基乙酸多用于巯基乙酸盐肉汤，既可以清除溶解氧，又能维持深层培养基的厌氧环境，适合试管深层培养。

连二亚硫酸钠还原能力极强，能够快速清除残留氧气。缺点是受热极易分解，不能随培养基一同高压灭菌，只能在接种前临时无菌添加，多用于苛刻厌氧菌的临时除氧。

2、氧化还原指示剂配合监测

在培养基中加入刃天青作为氧化还原指示剂。有氧状态下刃天青呈现粉红色，氧气被完全还原后变为无色。实验人员可以依靠颜色直观判断除氧是否达标。只要培养基保持无色透明，就证明溶解氧已经被彻底清除，这也是厌氧培养基质量控制最简便的手段。

3、厌氧罐/培养体系内除氧

除了处理培养基液相，还需要除去容器顶空气相中的氧气。厌氧罐内常用钯催化剂结合氢气，把罐内氧气和氢气反应生成水；也可以使用厌氧产气袋，袋内化学药剂反应产生二氧化碳与氢气，彻底消耗密闭空间内的氧气。该方法属于气相除氧，配合液相培养基除氧共同构建完整厌氧体系。

化学还原剂可以将培养基氧化还原电势降到-300 mV以下，创造严格厌氧微环境，弥补物理除氧后复氧的缺陷。缺点是部分还原剂对菌种存在毒性，浓度过高会抑制菌体生长；连二亚硫酸钠稳定性差，现配现用，不适合长期保存的培养基；长期添加还原剂容易改变培养基pH值，需要同步进行酸碱度校正。

培养基除氧是厌氧微生物培养的前置核心操作，物理除氧负责大规模去除溶解氧，化学除氧负责清除微量残氧，气相置换杜绝后续复氧。在实际实验中，不能单一使用某一种除氧手段，要根据菌种厌氧等级、培养基组分、实验规模灵活组合工艺。同时严格把控操作节奏，缩短培养基敞口暴露在空气中的时间，防止氧气再次溶解。规范的除氧操作可以显著提升厌氧菌的分离成功率，减少菌种氧化死亡，保障厌氧微生物实验数据稳定可靠。

三、产品展示

我公司有多种可用于厌氧培养的产品，客户可根据实际情况和用途进行选用。

表1 产品信息

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