别小看食品里的“捣蛋鬼”——蜡样芽孢杆菌鉴定技术大揭秘

你有没有遇到过吃完米饭、熟食之后上吐下泻？罪魁祸首很有可能就是蜡样芽孢杆菌！

这个小家伙在土壤、河水、粮食、即食零食里到处“串门”，属于蜡样芽孢杆菌复合群家族。它能搞出两种食物中毒：呕吐型和腹泻型。更棘手的是它自带“铠甲芽孢”，普通蒸煮、食品加工很难把它彻底干掉，妥妥是食品微生物监控名单里的重点盯防对象。

但这个家族还有一堆“长相双胞胎”：蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌……外表几乎一模一样，肉眼和老一套检测方法很容易把它们搞混。今天我们就聊聊，人类是怎么想方设法揪出这个食品捣蛋鬼，从传统培养到各种新潮快检技术，看看各路检测手段各有什么本事，又踩过哪些坑。

一、老当益壮的传统鉴定：慢，但是“法官级金标准”

国标GB 4789.14‑2014里规定的传统培养‑生化鉴定，就像法庭上的仲裁法官，结果具备最终效力。整套流程走下来要24‑72小时。简单说就是：取样、打碎混匀、梯度稀释、涂到选择性平板上面孵育，长出菌落之后再做一堆生化实验确认身份。

图1 蜡样芽孢杆菌的两种计数方法（GB 4789.14-2014）

1、选择性平板分离

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP琼脂）是国内国标指定分离培养基。多粘菌素B抑制多数革兰氏阴性菌；甘露醇、卵黄为底物。蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落呈粉红色；分泌卵磷脂酶分解卵黄中卵磷脂，菌落周围出现乳白色浑浊沉淀环；发酵甘露醇的杂菌呈黄色菌落，以此实现初筛，如图2所示。

图2 不同菌株在MYP琼脂的菌落特征

苏云金芽孢杆菌在MYP上菌落形态与蜡样芽孢杆菌几乎完全一致，无法区分；部分杂菌耐受多粘菌素，存在假阳性；少数卵磷脂酶缺陷菌株会漏检。

2、形态与生化鉴定

拿到可疑菌落之后，实验人员还要开启生化大考：革兰氏染色看形态、观察芽孢、溶血情况，再做动力、VP试验、硝酸盐还原等一整套测试，如图3和图4所示。现在有商品化生化鉴定条，可以半自动化干活，省心一点。可尴尬的是：依旧分不清家族内部的近亲，也看不出来这株细菌到底会不会产毒害人。

图3 蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别

图4 蜡样芽胞杆菌的部分生化实验

3、MPN计数法

适用于样品中蜡样芽孢杆菌含量较低的样品，依靠统计学最大可能数估算数量，操作工作量大，仅用于低污染样品检测。

传统培养法具有很多优势，可以获得活菌纯菌株，可开展后续毒力、耐药研究，作为仲裁金标准；但存在一些短板，检测周期长，无法直接判断菌株是否携带致病毒力基因，不能区分产毒与非产毒菌株。

二、升级培养基：显色时代，肉眼识别更轻松

随着微生物检测技术发展，显色培养基逐步应用于蜡样芽孢杆菌筛查，代表产品有海博生物的商品化显色琼脂。

1、蜡样芽孢杆菌显色培养基

里面加了多重抑菌物质，专门打压捣乱杂菌。依靠细菌产生的PI‑PLC 特异性酶来显色：蜡样芽孢杆菌复合群成员长出来是辨识度超高的蓝绿色菌落，其他杂菌要么长不出来，要么长出别的颜色。

图5 蜡样芽孢杆菌CICC 21261在显色培养基和MYP琼脂的特征

相比MYP琼脂，显色培养基判读直观，抗杂菌干扰更强；但依旧不能区分蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌，不同品牌底物配方存在差异；少数PI‑PLC缺陷菌株会出现假阴性，复杂基质样品仍需要生化复核PMC，如图5所示。

2、懒人神器—测试片技术

将营养、抑菌成分、显色底物固化于薄膜载体，省去配制倾倒琼脂步骤，简化操作，适合企业大批量样品筛查，如海博生物的菌落总数测试片，其性能优于国内厂家（菌落总数7cm测试片(AC)），目前多作为快速筛查手段，但尚未完全替代国标MYP平板，如图6所示。

图6 蜡样芽孢杆菌ATCC 11778在海博生物测试片的菌落特征

目前培养基发展趋势由单一生理生化表型筛选，向特异性酶底物显色方向发展；但所有选择性培养基仅完成初筛，不能实现菌种精准鉴定，更不能直接判定菌株产毒能力。

三、酷炫快速表型鉴定，几分钟出结果

1、MALDI‑TOF‑MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，听名字很高科技。原理就是读取细菌的蛋白质指纹图谱，和数据库比对，短短几分钟就能鉴定单菌落，国内出入境行业标准已经收录这个方法。

但是现实很骨感，蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌蛋白指纹太像，通用数据库经常脸盲分不清。想要识别准确，就得自己搭建本地专属数据库；而且它只能测纯化后的单菌落，不能直接拿原始食品样品上机检测。

2、免疫检测技术（ELISA、胶体金试纸）

试纸、试剂盒直接瞄准蜡样芽孢杆菌产生的肠毒素、呕吐毒素，直接测食品里面的毒素蛋白，速度飞快。但短板也很现实，不同批次抗体效果波动大，食品里复杂成分容易干扰结果；只能查到有没有毒素，拿不到活菌，做不到菌株溯源追踪。

四、分子生物学检测技术，扒开基因看本质

分子技术依靠核酸靶标，实现菌种鉴定、毒力基因同步筛查，弥补传统方法无法评价致病性的短板。常用鉴定靶标：gyrB、groEL；毒力靶标：腹泻毒素基因hbl、nhe、cytK；呕吐毒素质粒基因ces（呕吐型食物中毒关键标志物）疾病监测。

1、PCR与荧光定量qPCR

普通PCR用来鉴定菌种；多重PCR可以一次反应，同时读出菌种信息+多种毒素基因；荧光定量qPCR还能顺带定量。致命bug，分不清死细菌和活细菌的DNA，死菌残留核酸也会被扩增，给出虚假阳性。

PMA‑qPCR加入特殊染料，可以屏蔽死菌DNA干扰，可惜成本偏高，日常大批量检测很难普及。

2、恒温扩增技术（LAMP、RPA）

LAMP环介导等温扩增、RPA重组酶聚合酶扩增，不需要PCR仪热循环，恒温条件完成扩增，搭配浊度、荧光、试纸条可视化判读，适合基层现场快速筛查。RPA‑CRISPR‑Cas耦合体系进一步提升特异性，是近年研究热点；但试剂盒标准化不足，容易气溶胶污染，暂未成为国标仲裁方法。

3、全基因组测序WGS

二代、三代全基因组测序，是目前分辨能力最强的 “终极大招”。它不止精准区分近缘菌种，还能完成分型，全盘扫描毒力、耐药基因，完美分清蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；食物中毒暴发的时候，可以追踪细菌来源，理清菌株演化关系。奈何测序贵、数据分析门槛高，大批量常规检测用不起，多用于食物中毒溯源和科研。

五、未来会怎么发展

优化选择性显色培养基配方，提升对VBNC受损芽孢菌株复苏能力；开发可以同时提示产毒特征的新型分离培养基。

培养‑分子联合检测，可短时间复苏增菌后结合分子检测，兼顾活菌计数，同时检测毒力基因，规避死核酸干扰。现场便携快检技术，如RPA‑CRISPR、纸基芯片、智能手机可视化检测，面向食品现场筛查，简化设备依赖。

完善质谱数据库，扩充蜡样芽孢杆菌复合群本地质谱参考库，解决MALDI‑TOF难以区分近缘物种的难题。

基因组学走向应用，将全基因组测序应用于食源性疾病暴发溯源，不仅完成菌种鉴定，同时解析毒力、耐药特征，实现风险等级评估。

未来检测体系需要同时兼顾活菌计数+毒素/毒力基因筛查，避免只检测菌体忽略耐热呕吐毒素带来的食品安全隐患。

六、产品展示

我公司有蜡样芽孢杆菌相关的一系列培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

表1 产品信息

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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