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《中国药典》四部通则1105《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》是非无菌药品质量控制体系中的核心技术文件。它的功能在于定量评估供试品中能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的总数，判断其是否满足相应的微生物限度标准。2025年版药典已对该通则进行了系统性修订，在培养基适用性、检验量规定、菌数报告规则等多个环节作出重要调整，整体上向ICH Q4B及欧美药典协调靠拢。
一、三种计数方法及其适用边界
通则规定的计数方法有三种：平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。平皿法是使用频率最高的常规方法，又分为倾注法和涂布法。倾注法操作简便、结果稳定，适用于大多数非无菌制剂的常规计数；涂布法则便于观察菌落形态特征，但操作环节更多，对技术要求也更高。薄膜过滤法适用于含菌量较低的液体样品，通过将供试液经微孔滤膜过滤，使微生物截留在滤膜表面，再将滤膜贴覆于培养基上进行培养计数，从而实现对低浓度微生物的有效富集。MPN法基于概率理论估算菌数，精确度不及前两者，仅在供试品污染量极低且无其他适宜计数方法时才考虑使用。
方法选择需综合考虑供试品的理化特性（溶解性、抑菌性、是否含颗粒物）以及限度标准的要求。无论选择哪种方法，都必须先通过方法适用性试验确认其对该产品的适用性，这是通则的刚性要求，而非可选项。
二、方法适用性试验：回收率是核心判据
方法适用性试验的实质是回答一个问题：所用的计数方法能否真实、充分地检出供试品中可能存在的微生物？操作层面，取制备好的供试液，分别设置试验组（供试液加试验菌液）、供试品对照组（供试液加稀释液替代菌液）和菌液对照组（稀释液加试验菌液），经培养后计算回收比值。
对于需氧菌总数计数，通常使用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉五株试验菌；霉菌和酵母菌总数计数则使用白色念珠菌和黑曲霉。平皿法和薄膜过滤法的合格标准是：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值，与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2之间；MPN法要求试验组菌数落在菌液对照组菌数的95%置信限内。这个区间既允许一定的实验波动，又确保了方法不会系统性地漏检或高估微生物。
当回收比值不达标时，说明供试品中存在抑菌活性，需要采取针对性措施。常用的处理手段包括：增加稀释液或培养基体积以稀释抑菌成分；加入适宜的中和剂或灭活剂（如聚山梨酯80、卵磷脂等）消除抑菌活性。使用中和剂时，必须设立中和剂对照组，确认中和剂本身对微生物无毒性和干扰，其菌落数与菌液对照组的比值同样应在0.5～2范围内。
三、供试液制备与抑菌处理
供试液的制备是整个检验链条的起点。除另有规定外，一般取供试品10 g或10 mL，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2磷酸盐缓冲液溶解或稀释制成1:10供试液。对于水溶性较差的供试品，可加入适量表面活性剂辅助分散，但需确认其对微生物无毒性。对于制剂产品，2025版药典新增了检验量酌减的具体条件：批产量少于200的，检验量可减至2个单位；少于100的，可减至1个单位，但需进行合理性评估。
抗菌活性的消除是供试液制备中最具产品针对性的环节。不同抑菌成分需要匹配不同的中和策略：含酚类成分可选用聚山梨酯80，含汞制剂可用亚硫酸氢钠，含季铵盐类化合物则常用卵磷脂配合聚山梨酯80。若单一中和手段效果有限，可考虑将稀释、中和与薄膜过滤联合使用。
四、培养计数与结果报告
培养条件和计数规则直接决定结果的可比性。胰酪大豆胨琼脂培养基用于需氧菌总数测定，30℃～35℃培养3～5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌和酵母菌总数测定，20℃～25℃培养5～7天。计数时，需氧菌宜选取平均菌落数小于250 cfu的稀释级，霉菌和酵母菌宜选取平均菌落数小于50 cfu的稀释级，这是2025版较2020版最显著的数字变化（原分别为300 cfu和100 cfu）。
菌数报告的基本规则是：取最高的平均菌落数，计算每1 g、1 mL或10 cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。若各稀释级平板均无菌落生长，以小于1乘以最低稀释倍数的值报告。同一稀释级两个平板中，若菌落数平均值不小于15，则两平板菌落数不能相差1倍或以上，否则提示操作可能存在偏差。
五、2025版修订的核心变化与实务影响
2025版通则最值得关注的变化集中在三个方面。其一，培养基适用性检查要求每批培养基（包括商品化预制培养基、脱水培养基和按处方配制的培养基）均须符合适用性检查要求，不再接受抽批检查的做法。这意味着实验室需要对每批新到的培养基逐一进行促生长能力验证，对用量较大且灭菌条件不一致的实验室而言，检测工作量将明显增加。应对策略之一是优先使用商品化成品培养基，减少自配培养基带来的批间差异。
其二，菌悬液制备新增pH7.2无菌磷酸盐缓冲液作为可选缓冲液，同时黑曲霉孢子悬液制备中聚山梨酯80的浓度单位由mL/mL改为g/mL，使实验条件的表述更加标准化。
其三，检验量规定从笼统的“酌减”细化为基于批产量和活性物质含量的分级规则，气雾剂明确要求不少于10个包装单位。这些调整在给予检验人员更大操作空间的同时，也对实验室的记录规范和偏差管理提出了更高要求。
总体而言，通则1105的修订逻辑是清晰的，用更严格的培养基质控保障基础条件，用更精细的检验量分级适应多样化的产品形态，用更务实的报告规则减少边界模糊带来的争议。对于药品质量控制从业者而言，理解这一逻辑比逐条背诵规定更有价值，因为具体数字可能随药典版本更迭而变化，但方法学思维——方法确认先行、抑菌处理精准、报告规则明确——是长期稳定的工作准则。
注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。
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