影响 MS培养基凝固效果的几个因素的研究

    在植物组织培养过程中， 一般用琼脂作固化剂使培养胶化， 其凝固效果直接关系培养材料的生长或生存。 

    目前已有不少关于培养基高温高压灭菌后 pH值变化的研究；但对于影响培养基凝固效果的具体因素研究极少。笔者以 MS 培养基为对象， 探讨影响其凝固效果的多方面因素， 以利于组培材料的生长。

 

1 材料与方法

 

1.1材料与药品 M S培养基；琼脂条( 海洋食品有限公司制) ； 琼脂粉( 日本进口， 上海化学试剂) ；碳源：蔗糖、果糖、食用白糖、葡萄糖；活性炭。 

 

1.2方法  将母液兑成完全 M S培养基，用稀HC1或稀NaOH调节培养基的pH值至所需水平，在每个容量为 50m l的三角瓶中统一装入 30 m l培养基。在不进行其相关因素实验时，培养基中都是添加了3％蔗糖和 0.8％的琼脂粉，分装前pH值调至 5.8 ，118 ～120℃灭菌20 min。pH计型号pHS-3 c型酸度计，采用全量程复合玻璃电极，可精确设置被测溶液的温度，实现温度补偿，读数准确，方便快捷。3 次重复，灭菌后培养基置于25℃室内1h后观察，采取多次观察分析，用平均值进行结果统计。

 

2 结果与分析

 

2.1 琼脂浓度和培养基pH值对培养基凝固效果的影响

 

2.1.1 琼脂的浓度对MS培养基凝固效果的影响。表 1 显示，琼脂作为固化剂对培养基的凝固有直接影响，浓度的高低直接关系到培养基的凝固效果，培养基的凝固效果与琼脂用量呈正相关。一般情况下，琼脂浓度低于0.6％，培养基就不能很好地凝固，当浓度达0.8 ％一般就能满足实验要求。琼脂在培养基中仅作为固化剂，但其中含有多种杂质成分，可能对培养基成分会有一定的影响，在用量上应加以考虑。日本进口的琼脂粉比琼脂条的凝固效果稍好 ，主要是因为琼脂条的杂质多，琼脂粉的有效成分相对高一些。这与陈永勤的研究结果相反。 

 

表 1 琼脂浓度和培养基 pH值对培养基凝固效果的影响

 

 

 

注： 大、 小写字母分别表示进口琼脂粉和国产琼脂条。A或( a ) ， 凝固很差、 完全液体状态； B或( b ) ， 凝固差、 稀糊状； C或( c ) ， 凝固一般、 轻晃动时会滑动； D或( d ) ， 凝固较好、 不太滑动； E或( e ) ， 凝固好、  不滑动； F或( f ) ， 凝固很好、 很硬、 培养基上有一层水。下表同。

 

2.1.2  pH值对MS培养基凝固效果的影响。M S培养基的凝固与p H值呈正相关。当p H值低于 5.5 0时， 培养基一般不能很好地凝固， 随 pH值的提高，培养基的凝固效果明显改善。植物组织在一定pH值下才能正常生长，因此在配制时考虑培养基凝固情况的同时， 也要注意 pH值的大小。 

 

2.1.3 琼脂的用量与培养基 pH值的互补作用。试验表明，当琼脂浓度过小时， 可通过提高培养基的pH值来改善凝固效果；当pH值低时也可以通过增加琼脂的浓度来改善凝固效果 ， 这与陈永勤的研究相一致。 

 

2.2 碳源对 MS培养基凝固效果的影响   

 

在培养基中一般要加入一定量的碳源， 碳源有降低培养基灭菌后凝固效果的效应。表 2显示， 碳源添加后，灭菌后培养基的凝固效果明显降低，降低程度与所添加的碳源量呈正相关； 不同碳源培养基的下降程度有差异：添加 3％蔗糖、2％食用白糖、1％葡萄糖或1％果糖时就能明显降低培养基灭菌后的凝固效果。相同条件下， 果糖与葡萄糖的影响较大， 能显著降低培养基的凝固效果，下降程度是果糖 >葡萄糖 >食用白糖>蔗糖。 

 

添加一定量的碳源促进了培养基灭菌过程中pH值的下降。B a l l 认为在高温灭菌时， 培养基中蔗糖会水解成果糖和葡萄糖 ，而葡萄糖进一步变成葡萄糖酸，从而导致培养基pH值的下降。碳源在灭菌过程中水解，形成酸性物质，使培养基pH值下降，从而凝固效果降低。添加果糖、葡萄糖影响明显，由于高温灭菌后，果糖培养基的pH值比葡萄糖的下降幅度大得多， 更易形成酸性物质。 

 

表2 碳源对MS 培养基凝固效果的影响

 

 

注： “ +” 表示凝固效果略高于标记水平； “一” 表示凝固效果略低于标记水平。表4同。 

2.3 灭菌时间及灭菌温度对 M S 培养基凝固效果的影响

 

由表3可知，经高温高压灭菌后培养基的凝固效果呈下降趋势，灭菌时间和灭菌温度均不同程度地影响M S培养基的凝固效果。130℃以下灭菌 l2 、15、18 、20 m i n 后培养基的凝 固效果稍有降低，各个处理表现基本一致，无明显差异；但当灭菌时间达25 m i n以上或灭菌温度达 130℃时 ，培养基的凝固效果呈急剧下降， 使原凝固很好的培养基凝固不好或根本不能凝固。这可能是在高温或长时间高压下，琼脂的有效成分结构被破坏，凝固能力减弱 ； 同时培养基一些营养物质在高温下水解成酸性物质，造成培养基pH值下降。常规高温高压灭菌温度 118 ～125℃， 灭菌时间15～20 m i n ，培养基的凝固会有所下降，主要是因为培养基在经高压灭菌后 p H值下降了，pH下降的原因可能是高温灭菌时E D T A铁盐和其他微量元素发生了相互作用。

 

2.4 添加活性炭对 M S 培养基凝固效果的影响

在植物组织培养中为了吸附植物的有害泌出物或防止组织褐变等，在培养基中通常加入一定量的活性炭。表 4显示， 在高压灭菌后培养基的凝固程度明显下降，但灭菌前加入活性炭的培养基凝固程度会急剧降低，能降低一到两个凝固级别；活性炭的含量不同， 降低的程度略有差异， 但差异不大。 

 

表3 不同高温下灭菌不同时间对M S 培养基凝固效果的影响

 

 

 

活性炭具有很强的吸附能力 ，有削弱琼脂凝 固能力的作用。在配制培养基时要增加琼脂的量或提高p H值来改善培养基在灭菌后的凝 固状况。 

 

 

表4 不同浓度活性炭对MS培养基凝固效果的影响

 

 

2.5 晃动培养基对凝固效果的影响

在培养基冷却凝固过程中，晃动培养基也对培养基的凝 固效果有较大影响， 影响程度与晃动剧烈程度呈正相关 ，对 B ( b ) 、C ( c ) 、D( d ) 、E ( e ) 状态的培养基影响十分显著， 使凝固不好的培养基不能凝固，凝固好的不能很好地凝 固。但对于不能凝 固的和很硬的培养基影响不大( 表 5 ) 。这在 N6 、B5等培养基凝固反应上是一致的。在实验中经常用到的是 D( d ) 、E ( e ) 两种凝固状态， 因此晃动培养基对凝固效果也有一定影响。晃动培养基主要是破坏了琼脂的结构。

 

表5 晃动培养基对培养基凝固效果的影响

 

 

注： I.轻轻摇晃 2圈；

Ⅱ. 在I 的基础上稍加大力度， 摇晃4圈；

III.摇 6圈；

I V.摇晃8 ～1 0圈；

V.剧烈晃动培养基。 

 

3 小结与讨论

 

通过分析琼脂的浓度、培养基的p H、灭菌时间及灭菌温度、碳源、活性炭、晃动培养基对 MS 培养基凝 固效果的影响，表明 MS 培养基的凝固效果主要是受琼脂浓度和培养基的p H值影响；高温高压灭菌后培养基凝固不好 ，主要是因为培养基的 p H值下降了， 灭菌时间 、灭菌温度 、碳源 、活性炭等因素影响 MS培养基的凝 固， 主要是因为它们在灭菌的过程中有改变培养基p H值的效应。在其他培养基如 N 6 、 B 5 、 Wh i t e等培养基效果也同样主要受这两方面因素的影响； 相同情况下， 培养基之间的凝固效果不同， 主要是 因为在高压灭菌过程中影响因素的影响效应有所差异。在植物组织培养过程中， 培养基的 D H值是 由培养的植物材料不同而决定 ，但培养过程对培养基的凝 固效果的要求并不因p H值而变， 所以对某种特定培养对象，即要考虑培养对象所要求的 p H值， 又要通过调整某些因素保证培养基具有一定的凝固程度。