《水生微生物实验法》——水中霍乱弧菌的分离检验

感染了霍乱弧菌可能引起急性传染病——霍乱．1883年世界上霍乱大流行时，科克（Koch）在埃及的病人体内分离培养而且获得证实霍乱弧菌的存在。解放后在我国没有发现此疾病的流行。但由于病人的吐泻物可能污染水源，不能保证在辽阔的沿岸、港湾、河口等处没有霍乱菌的存在，因此对水源中霍乱弧菌的分离检测，有利于预防霍乱疾病的发生。

1 ．培养基制备

（1）碱性蛋白胨水培养液：

NaNO₃  2 克

NaCl   5 克

蛋白胨10 克

蒸馏水1000 毫升

将上述三种成分溶解于水后，用15%氢氧化钠溶液约10 毫升调pH 为8.8-9.0．于121℃下灭菌20 分钟。

（2）雪氏（Senenray ）蛋白胨水．

蛋白胨20克

NaCl 30 克

蒸馏水1000毫升

将前两种溶解于水．调pH8.4，于121℃ 蒸汽下灭菌20分钟。

（3）阿伦森氏（Aronson ）培养基：

3%肉膏琼脂（pH7.4-7.6) 100 毫升

10%无水Na₂CO₃溶液5-6 毫升

20%蔗糖溶液5毫升

20%糊精溶液3毫升

碱性复红酒精饱和溶液0.4 毫升

10 ％无水Na₂SO3溶液2 毫升

制法如下：

① 将己灭菌的肉膏琼脂加热溶化加入碳酸钠溶液6 毫升混合。

② 加蔗糖、糊精、复红及亚硫酸钠溶液，混合，置于阿诺德氏灭菌器内，以间歇蒸汽灭菌15分钟，此时可有部分沉淀形成．

③ 将上层清晰的培养基倒于培养皿，制成平板，备用。但不得保存过久，一般在3 天内用完。

（4）亚碲酸钾蛋白胨水及亚碲酸钾琼脂平板成分及制法：

① 可溶性淀粉0.5克

蒸馏水10 毫升

将可溶性淀粉溶于蒸馏水混合，煮沸2 分钟（待淀粉透明即可）.

② 牛肉膏0.3-0.5克蛋白胨1 克

KNO₃ 0.1克

MgCl₂ 0.1克

NaCl  1 克

蒸馏水9O 毫升

③ 0.2%亚碲酸钾水溶液，用赛氏滤菌器过滤，或阿诺德氏灭菌器加热100℃ 30 分钟．

④ 制法；将② 中诸物混和加热至全部溶解，将① 全部加入，待冷至50-60℃ ，滴定pH 为9.2, （用0.04％溴麝香草酚蓝作指示剂），分装于三角瓶中每瓶100 毫升，112.6℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。使用前每100毫升加入已灭菌的0.2%亚碲酸钾水溶液1 毫升及0.5%蔷薇酸酒精溶液l 毫升，混合后以无菌操作技术分装于无菌试管中，每管5-10 毫升．

如果制备固体培养基时，可在② 液内加2-3 %琼脂，其他各步与上述相同，最后倾入平皿，制成平板培养基．

2 ．增菌培养

取水样900 毫升加到内含5%氯化钠和10%碱性质白胨水的无菌混合液100 毫升（pH9.0）于37 ℃ 下培养24 小时。或取水样1-2升，在赛氏滤器上过滤，将其滤纸放于碱性蛋白水溶液、或放于雪氏蛋白胨水中作增菌培养24 小时．

3 ．分离培养

取少量的增菌培养液在阿伦森氏平板培养基上涂布接种．于37 ℃ 下培养12-24 小时。霍乱弧菌的菌落呈鲜红色，大肠杆菌群的菌落较小呈淡红色。

如果将增菌液涂布于亚蹄酸钾琼脂平板．在37 ℃ 下培养8-12 小时，由于其中蔷薇酸抑制革兰氏阳性细菌．亚碲酸钾抑制其他革兰氏阴性菌生长，仅霍乱弧菌能还原亚碲酸钾，形成黑色菌落。因此，这种培养基更适合于分离霍乱弧菌。

4 ．镜检

挑取典型菌落制片．染色镜检和悬滴镜检，若为革兰氏阴性，运动活泼的弧菌，则可初步确定所分离的是霍乱弧菌。

5 ．生理生化检验

根据霍乱弧菌的生理生化特征可分为四个生物类型，进行生理生化试验时可按2-8 的项目进行。

表2-8 霍乱弧菌四个生物型的特征区别

注：d多种生化反应，(+)^o为迟缓反应。+阳性反应，-阴性反应