产银杏内酯B内生真菌的分离与筛选

银杏(Ginkgo biloba Linn)为银杏科银杏属 落叶高大乔木，系侏罗纪的孑遗植物，是植物界 的“活化石”，我国已将其列为二级重点保护植物。 银杏中含有多种化学成分，其中具有药用价值的成分主要为黄酮类化合物，萜内酯类化合物和酚 酸类化合物nj。目前对黄酮类化合物的研究较广 泛深入，但随着近年银杏内酯的药理作用及临床效果的广泛报道，关于银杏内酯类化合物的研究 呈迅猛增长的趋势。银杏内酯的药理作用主要是 抑制血小板凝集、降低血液粘度、减少血栓形成、改善缺血病人微循环_2 ]，在各种银杏内酯单体中 银杏内酯B的抗PAF(血小板活化因子)活性最 强。目前得到银杏内酯B的主要途径是从银杏 叶中直接提取，这难免会导致资源的枯竭，而且生 产也受到很大的限制。植物内生真菌几乎存在于 所有目前已研究过的植物中，并且一些内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。已 经先后从红豆杉、长春花、桃儿七、杜仲等植物中 分离出能够产生活性成分的内生真菌_6。，近几 年也有报道从银杏中分离出产黄酮类化合物的内生真菌⋯]，但从银杏中分离的内生真菌中产银杏 内酯的研究报道较少，本文试图从银杏中分离产 银杏内酯的内生真菌，并对菌类进行初步鉴定，探讨发酵法生产银杏内酯的可能性，为今后的工 业化生产奠定基础。

 1 材料与方法

 1．1 材料

 1．1．1 菌种分离源 分离所用材料为银杏的根、 茎、叶和果，于2006年10月采自西北农林科技大 学林学院校园内，树龄从5 a到40 a不等，树体 健壮，无病虫害。

 1．1．2 培养基 菌种分离用培养基：马铃薯葡萄 糖琼脂培养基(PDA)、察氏培养基。液体培养基：马铃薯葡萄糖培养基。

 1．1．3 主要仪器 SW2CJ2FD超净工作台(苏净集团安泰公司)、ES2315高压灭菌锅(TO— MY)、SPX2300B2 1I生化培养箱(上海跃进医疗 器械厂)、HWY211大容量恒温振荡器、V 8三用 紫外分析仪(无锡科达仪器厂)、LC22010A 高效液相色谱仪、SCL210A紫外检测器(VP)和光学 显微镜。

 1．1．4 标准标品和试剂 银杏内酯B标品纯度大于99 硅胶H(青岛 海洋化工厂)；醋酸钠(分析纯)；羧甲基纤维素 钠(上海试剂厂)；乙酸酐(广州试剂厂)；甲苯 (分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，丙酮(分析纯)，甲 醇(分析纯)，甲醇(色谱纯)，重蒸水，四氢呋喃 (色谱纯)。

 1．2 方法

 1．2．1 内生真菌的分离、纯化和保藏

 采用 常规组织分离法，分别取银杏的根、茎、叶、树皮和果实，用75 乙醇浸泡1 min，然后用无菌水冲洗 3～4次，再用2．5 次氯酸钠浸泡3 min，将组织 切割成0．5 cm×0．5 cm左右的小块，使切割处接触培养基植于其上，采用组织印迹法作对照来检验 表面消毒是否彻底。将培养基置于28℃恒温培养 箱中培养3～7 d。定时观察，将新长出的菌丝用接 种针依次转接到新的固体培养基上，每株菌纯化2 ～ 3次后转接到试管斜面上保藏，各两支。

 1．2．2 内生真菌的液体培养 液体培养基为马 铃薯葡萄糖培养基，250 mI 的三角瓶装液量为 100 mI 。用接种针挑取少许菌丝接种于培养瓶中，28。C、180 r／min培养7 d后，4 000×g离心除去菌丝体，上清发酵液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液后旋转蒸发至干，再用5mL甲醇 溶解备用。

 1．2．3 薄层层析法(TLC)检测Ⅲ1。薄层板：4 乙酸钠的0．5 羧甲基纤维素钠溶液作粘合剂的硅胶H板；展开剂：甲苯：乙酸乙酯：丙酮：甲 醇一5：2．5 ：2．5 ：0．3，将制好晾干的薄层板置于110℃活化30 min，再将样品和标品点样于 硅胶H板上展层，将展开晾干后的薄层板喷醋酸酐，于165℃加热40 min显色，365 nm波长观察 荧光斑点。

 1．2．4 高效液相色谱法(HPLC)检测 采用单 点校正的办法来定量银杏内酯B的含量。精密 称取银杏内酯B标品5 mg溶解于10 mI 色谱甲 醇制成标品溶液，样品溶液的制备参见1．2．2，标 样和样品在上样前过0．45 fm 滤膜。HPLC检 测条件为：迪马ODS C18色谱柱(250 mm × 4．6 mm ，5fm)；柱温25℃ ；流动相：水：甲醇 ：四氢呋喃一70 ：20 ：10；进样量20 L ；流 速1．0 mL／min；检测波长219 nm。

 1．2．5 菌种鉴定   真菌鉴定按常规方法进 行。挑取纯化的菌株尖端菌丝接种于察氏培养基 上。按如下各种方法培养一段时间后观察菌落、 菌丝体和孢子的形态特征并进行鉴定。

 载片培养观察法(观察孢子及菌丝体形态)： 将培养基琼脂薄置载玻片上，接种后盖上盖玻片 培养，真菌即在载玻片与盖玻片之间有限的空间内沿盖玻片横向生长。培养一段时间后，将载玻 片置显微镜下观察。插片法(观察基内、气生菌丝)：将真菌接种到平板上，插上灭菌盖玻片后培 养，使菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生 长而附着在盖玻片上。观察时轻轻取出盖玻片，置载玻片上直接观察。

 2 结果与分析

 2．1 银杏内生真菌分离

 从银杏的不同部位共分离到109株内生真 菌，其中从树根、皮、叶子和果实中分离到的菌株 数分别为33、15、57和4株。从分离纯化的结果来看从树根和树叶中所分离到的内生真菌较树皮 和果实中的数量多。

 2．2 薄层层析(TLC)法分析结果

 用展开体系对分离到的109株内生真菌发酵 浓缩液进行层析，初步筛选能够产生银杏内酯B或其类似物的菌株，结果发现有16株菌和标品有 相同的迁移位点和相似的斑点颜色，图1为G10 菌株样品的薄层色谱分析图谱，在加入改良剂醋 酸钠的情况下可使得薄层分析的精度得到很大的 提高，可以去除银杏内酯其他单体的干扰作用，但是因为发酵液样品中可能存在其他杂质，致使薄 层分析结果容易出现假阳性，故对初步筛选出来 的16株菌进行了液相色谱分析。

 2．3 高效液相色谱(HPLC)法分析结果

 对TLC方法初步筛选出来的16株菌的发酵 浓缩液进行HPLC分析，在1．2．4中的条件下， 标样的保留时间为29．361min，16个样品中编号为G10、Y3o和Y4o的3个样品和标样有相近的 保留时间，分别为29．531、29．460和29．949 min。根据出峰面积采用单点校正自龟方法计算出 发酵产量分别为9．3 mg／I 24．3 mg／L和64．3 mg／L，但TLC分析中样品Y30和Y40的斑点颜 色和标品银杏内酯B斑点颜色不相符合，它们产生的是否为银杏内酯B，还有待于进一步试验。 故只确认菌株GlO产生银杏内酯B。试验中发现 在薄层板上样品G1和G8与标品不但有相同的迁移率而且有相同的斑点颜色，但在液相色谱的 色谱图上没有发现和标品有相同保留时间的出 峰。推测原因可能是发酵液中目标产物浓度低，加上银杏内酯类物质紫外吸收很弱，因此在色谱图上没有检测到该样品中含有该物质。图2和图 3为标品和样品Glo的HPLC图谱。

 2．4 内生真菌鉴定

 从银杏中共分离出109株内生真菌，对在TLC 分析和HPLC中与标品有相同迁移率和相同保留时间的3株内生真菌进行鉴定，经显微形态观察， 初步判定GlO为卵形孢霉属(Oospora Wallr．)、 Y30为枝链孢霉属(Sirodesmium de Not)、Y40为青霉属(Penicillium LK．ex Fries)，其生长特性和显微形态及鉴定结果见表1

 3 结论

 3．1 采用常规的组织分离方法从银杏植物不同组 织部位共分离出内生真菌109株，其中从树根中分 离到的有33株、树皮中15株、叶中57株、果实中4 株，这表明在健康的银杏组织内部确实存在大量的 不使宿主植物表现出明显感染症状的内生真菌，而 且其数量分布跟宿主植物的组织部位有关。

 3．2 TI C分析结果发现有16株菌与标品有相 同的迁移位点和相似的斑点颜色，HPI C进一步 分析后观察到有3株菌的发酵浓缩液与标品有相同的保留时间，综合在薄层板上的荧光显色和在液相色谱上的保留行为确定菌株G10为可以产 生银杏内酯B的内生真菌，表明从宿主植物中分离到的部分内生真菌确实可以产生和宿主植物内部 含有的相同的生物活性物质。试验中发现菌株G1 和G8在薄层板上和标品有相同的迁移率和相同 颜色的斑点，但在液相色谱上却没有显示出来有相 同保留时间的出峰，推测菌株G1和G8也可能产 生银杏内酯B，但含量很少，用HPLC-UV检测不 出来。因此选择G10为后续试验的出发菌株。

 3．3 对液相色谱分析中有相同保留时间的3株 菌G10、Y30和Y40进行形态学观察，包括菌落 形态、菌丝体生长状态和分生孢子的着生情况，初步鉴定分别为卵形孢霉属(Oospora wallr．)、枝链 孢霉属(Sirodesrniurn de Not)和青霉属(Penicil— Zium LK．ex Fries)

作者：包飞、樊明涛、贺江

作者单位：西北农林科技大学食品科技与工程学院

上一篇：柠檬醛抗真菌及抑制黄曲霉产毒的试验报告

下一篇：大扶康、大蒜素、大蒜油注射液对深部真菌的抑杀作用