液芯包囊化清酒乳杆菌增殖培养基的优化（2）

2结果与讨论

2．1碳源、氮源、促生长因子和CaCO₃ 浓度对包囊化清酒乳杆菌增殖的影响 

2．1．1不同碳源对包囊化清酒乳杆菌增殖的影响

在基础培养基的基础 E，分别以蔗糖、乳糖及麦芽糖加入培养基中，浓度均37℃培养20h后，进行囊内细胞计数。结果如图一所示。

从图 1 可以看出，包囊化清酒乳杆菌最佳碳源为葡萄糖。 

2．1．2不同氮源对包囊化清酒乳杆菌增殖的影响

本试验分别选用牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨及酵母粉加入基础培养基中， 浓度均为2．0 ％，37℃培养20h后，进行囊内细胞计数。。 结果如图2所示。

从图2可以看出，包囊化清酒乳杆菌最佳氮源为蛋白胨。 

2．1．3生长因子对包囊化清酒乳杆菌增殖的影响

本试验选择了目前报道较多的番茄汁、胡萝卜汁和玉米浆三种物质进行了研究，分别向培养基中添加不同浓度的番茄汁、胡萝卜汁和玉米浆，37℃培养20h后，进行囊内细胞计数。结果如图3所示。 

从图3可以看出，番茄汁为包囊化清酒乳杆菌最佳生长促进物质。 

2．1．4不同CaCO₃ 浓度对包囊化清酒乳杆菌增殖的影响     

在液芯包囊增殖培养基中添加适量CaCO₃，可以起到增加胶囊的强度，缓冲环境pH值的作用，为乳酸菌提供良好的生长坏境。

从图4可以看出，随着CaCO₃ 浓度的增加，细胞密度先是增加，CaCO₃ 浓度超过0．5 ％时，随着CaCO₃ 浓度的增加，细胞密度反而减少。因此增殖培养基中pH缓冲剂CaCO₃的浓度选择0．5％。

2．2响应面分析优化包囊化清酒乳杆菌增殖培养基  

为了最优拟合多元二次模型方程各项系数， 依据实验设计表进行了30组试验，其结果见表2。通过Design Expert 软件对表2中实验数据进行二次多项回归拟合，获得 L．sake菌体浓度对葡萄糖、蛋白胨、番茄汁以及CaCO₃ 的二次多项式回归方程：

Y =10．54-0．040x_l + 0．12x₂- 0．035x₃-0．058x₄ - 0．16 x_l² - 0．18x₂ ²-0．080x₃- 0．14 x₄²- 0．060x_l x ₂ -0．030x ₁x ₃ + 0．041x _l x₄ +0．035x ₂ x ₃ -0．054x₂ x₄ - 0．01lx₃ x₄

式中，Y为L．sake菌体浓度的预测值，x₁、x₂、x₃、x₄分别为葡萄糖、蛋白胨、番茄汁以及CaCO₃ 的编码值。

由以上方程得出的 L ．s a k e菌体浓度预测值见表 2 。该二次回归方程及其各项的方差分析结果见表3。

从该方程的方差分析表3可见，该模型极显著( P < 0．0001)，失拟项在：0．1水平上不显著(P = 0．1148> 0．1)，模型的校正确定系数 (Adj R- Squared)R_Adj ²=0．9618，表明模型能解释包囊化清酒乳杆菌菌体浓度响应值的变化。因而该模型与实际情况拟合很好，可用于预测．sake的实际增殖情况。 

上述方程的回归系数显著性检验表明：试验各因素对L．sake菌体浓度的线性效应皆显著；且其对L．sake菌体浓度的曲面效应也显著；x₁ x₂、x₁x₄、x₂ x₃和 x₂x₄的交互作用显著， 而x₁ x₃、x₃x₄ 的交互影响不显著。

2．2．2 L．sake茵体浓度响应面交互作用分析与优化

多元二次回归方程所作出的响应曲面图及其等高线图见图5-图 10，各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。 

图5显示了番茄汁和 CaCO₃ 位于中心水平时，葡萄糖与蛋白胨对 L．sake菌体浓度交互作用的3-D图及等高线。由图5可知，在一定范围内L．sake菌体浓度随着葡萄糖浓度的增加而增加，但当葡萄糖浓度超过l9．32 g／L时，反而抑制了，L．sake的增殖。在葡萄糖浓度一定时，菌体浓度随着蛋白胨浓度的增加先快速增加后下降。葡萄糖和蛋白胨浓度基本在 l 6．88- 21．67g／L和19.3 8 - 23．75 g／L范围内，L．sake菌体浓度可以达到本次实验的最大值。这说明了菌体的生长繁殖需要适量的碳、氮源：碳源浓度过高，培养基中的pH随发酵时间的延长其值下降过快，影响培养基中营养物质离子化成程度，从而影响微生物对营养物质的吸收；氮源浓度过高，会导致菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶。

袁 媛等： 液芯包囊化清酒乳杆菌增殖培养基的优化

表3 二次多项模型及其各项的方差分析表

图6显示了葡萄糖与CaCO₃ 对L．sake菌体浓度的交互影响效应。由图6可知，在

CaCO₃ 试验水平范围内，菌体浓度随着葡萄糖浓度的增加呈先上升后下降的趋势。在葡萄糖试验水平范围内，菌体浓度随 CaCO₃，浓度的增加呈先上升后下降的趋势。当葡萄糖与 CaCO₃，分别保持在l7．86-21．25 g／L和 3．86 - 5．25g／L范围内时，可以获得本次实验的最大菌体浓度。这表明在增殖培养基中添加适量 CaCO₃ 可以起到增加胶囊的强度， 缓冲坏境pH值的作用，但过量反而不利于细胞的生长。

图7显示了蛋白胨与番茄汁对 L．sake菌体浓度的交互影响效应。由图7可知，在番茄汁浓度一定时，菌体浓度随蛋白胨浓度的增加呈先上升后下降的趋势， 在其浓度处于19．17 -23．16 g／L范围内，L．sake菌体浓度可以达到本次实验的最大值。番茄汁是天然的果蔬汁， 营养丰富，含有乳酸菌生长不可缺少的核苷酸和矿物质 f 8 ] 。但从图7看，并不是越高浓度的番茄汁对，J．sake的生长越有利，只有在83．33-111．43mL/L浓度范围内，才可以获得本次试验的较高菌体浓度。此现象证明了L．sake是异养菌，它的酶系比较单纯，不能合成多种氨基酸、维生素以及生长因子，为了使该菌增殖，必须在培养基中补充这些营养物质。但过高浓度的营养物质反而不利于菌体的生长。

蛋白胨与CaCO₃ 对 L．sake菌体浓度的交互影响效应见图8。由图8可见，在本实验水平范围内，随着培养基中蛋白胨含量的增大，L．sake的菌体浓度增加，但当蛋白胨浓度超出一定量时， 反而抑制了L．sake的增殖。即当蛋白胨浓度处于19．16- 24．37g／L范围内， 菌体密度可以达到本次实验的最大值。当蛋白胨浓度一定时， 菌体浓度随CaCO₃ 浓度的增加呈先上升后下降的趋势，只有当 CaCO₃ 浓度保持在3．33 - 5．67g／L范围内，才可获得最大菌体密度。

图9和图10分别显示了葡萄糖与番茄汁、番茄汁与CaCO₃，的交互影响效应。表明两者的交互作用均不显著。

为了获得培养基组分的最佳点，对L．sake菌体浓度的二次多项数学模型解逆矩阵， 得到模型的极值点：葡萄糖 l8．87g／L，蛋白胨21．98g /L，番茄汁98．62 mL/L，CaCO₃ 4．3 9g／L。即最后优化的增殖培养基配方为(L^-1)：乳清粉60 g，葡萄糖18．87 g， 蛋白胨21．9 8g，番茄汁98．62m L，CaCO ₃ 4．39g， MgSO₄ 0．28g，MnSO₄ 0．05 g。在此条件下再进行验证实验，得出菌体浓度(lg cfu／g)为10．59， 接近于软件的预测值10．57 lg (cfu ／g)。

3结论

响应曲而法(RSM) 是优化和评价影响生物产量的各种因变量水平和交互作用的有效方法之一。 该法已经被广泛地应用于各类培养基以及发酵条件的优化^[10-12]。

为了提高包囊化清酒乳杆菌的菌体浓度，本研究首先通过单因素实验，确定了包囊化清酒乳杆菌的最佳碳源为葡萄糖；最佳氮源为蛋白胨；最佳促生长因子为番茄汁；pH缓冲剂CaCO₃，最佳浓度为0．5％。在此基础上，采用旋转中心组分设计、响应曲面法对以上四个关键培养基组分进行了优化，得出最佳响虚值。最终优化所得的增殖培养基配方为(L^-1)： 乳清粉60 g，葡萄糖18．87g，蛋白胨21．98g， 番茄汁98．62 mL，CaCO₃ 4．39 g，MgSO₄ 0．28g，MnSO₄ 0．05g。在此优化条件下，其囊内细胞密度达到l0．59 lg (cfu／g )， 为肉品直投式发酵剂的生产提供了依据和保证。

作者： 袁媛¹，陈晓红¹，姜梅¹，努尔古丽·热合曼^1,2，Muhammed MalikHashim^1,3， 董明盛¹

作者单位： 1南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095：2新疆师范大学生命科学与化学学院； 3Gomal University，D．I．Khan，Pakistan 

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