五种培养基分离E1-Tor霍乱弧菌比较

4号 、庆大 、亚胆 、亚洗、双洗都是分离 El—Tor霍乱弧菌的常用培养基。我们利用浙江省卫生防疫站制备的上述几种培养基成品，对污染不同量 El—Tor霍乱弧菌的大便标本进行了分离培养，现将实验方法和结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 抑制剂

1.1.1  1％ 亚碲 酸钾 ；

1.1.2  250μ/ml庆大霉素(芜湖制药厂)；

1.1.3  10％胆汁酸盐；

1.1.4  1500μ／ml多粘菌素 B(英国进口)；

1.1.5  0.1％硫酸双氢链霉素(上海第十制药厂)；

1.2 培 养基

1.2.1  碱性胨水   取碱性胨水粉末 26g，加 l000ml蒸馏水，加热溶解，分装试管，15磅 15min高压灭菌。

1.2.2  碱性琼脂   取碱性胨水粉末26g，牛肉膏3-5只，加1000ml蒸馏水，加热溶解，校正 pH8.4，分装，加 1.2％琼脂粉，15磅高压灭菌，待冷至 5O℃左右，倾注灭菌平皿。

1.2.3  4号琼脂   取4号琼脂粉44g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，煮沸二次，待冷至50℃左右，加 1％亚碲酸钾 lml，500μ／ml庆大霉素 lml，充分混匀 ，倾注灭菌平皿。

1.2.4  亚胆琼脂  取亚胆琼脂粉42g，加 1000ml蒸馏水，加热溶解，15磅高压灭菌，待冷至50℃左右，加10％胆汁酸盐 15ml，1％亚碲酸钾 lml，充分混匀，倾注灭菌平皿。

1.2.5 庆大霉素琼脂  取庆大霉素琼脂粉53g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，15磅高压灭菌，待冷至 50℃左右，加250μ／ml庆大霉素2ml，1500μ／ml多粘菌素 B 2ml，充分混匀，倾注灭菌平皿。

1.2.6 亚洗琼脂 取蛋白胨20g，氯化钠5g，洗衣粉(上海 )2.5g，牛肉膏 3—4g，先加少量蒸馏水溶解，再加蒸馏水至 l000ml， 校正pH8.4，加1.2％琼脂粉，15磅高压灭菌，待冷至50℃左右，加1％亚碲酸钾1ml，充分混匀，倾注灭菌平皿。

1.2.7 碱性琼脂斜面   高压灭菌。

1.2.8  0.85％生理盐水  高压灭菌。

1.2.9  El—Tor霍乱弧菌(系1980—1981年各县分离上送菌株)；

80—953号：稻叶非溶复株(黄岩)；80—409号：稻叶复愈株(临海)；80—1124号：稻叶复愈株(三门)；81—1号：小川溶源株(温岭)；81—166号：小川复愈株(黄岩)；81—118号：小川 复愈株(黄岩)。

1.2.10 大便标本   采自台州医院肠道门诊化验大便，共30 份，其中：粘液便8份、稀便4份、水样便1份、脓血便1份、黄软便16份。

1.2.11  霍乱弧菌“O”多价诊断血清  系上海生物制品研究所提供，效价1：1280／+，经 1：20稀释使用。

1.3 方法

1.3.1 用细竹签挑取2g左右大便，接种于碱性胨水管内，置37℃增菌6h。

1.3.2 将37℃12h斜面琼脂培养后的El—Tor霍乱弧菌，用灭菌生理盐水洗下，用比浊法测定弧菌量，并稀释成 64万个／ml、32万个／ml、16万个／ml、8万个／ml、4万个／ml弧菌悬液，然后，吸取 1ml加入增菌后的胨水管内，充分混匀，置室温30min。

1.3.3 用同一接种环挑取上述含有不同菌量El—Tor霍乱弧菌的大便增菌液，分别以一满环划种于已烘干表面水份的亚洗、庆大、双洗、亚胆，4号各一只培养基上，经37℃12h及24h 培养后，分别观察结果。

1.3.4 挑取 El-Tor霍乱弧菌可疑菌落，用1：20稀释的霍乱弧菌“O”多价血清做玻片凝集；阴性者，再挑选5-10只菌落凝集。

2 结果

2.1 五种培养基分离人工污染 El—Tor霍乱弧菌，结果见表 1。

表 1 五种培养基分离人工污染 El—Tor霍乱弧菌结果

注 ：表内 “+”表示 阳性 ，“-”表 示阴性

从表 l可知，五种培养基同时分离30份人工污染 El—Tor 霍乱弧菌，经37℃12h培养，4号、庆大、亚胆、双洗、亚洗平板检出率分别为 90.0％、33.3％ 、6.7％ 、20.0％、0％；经 37℃24h培养，其检出率分别为 90.0％ 、40.0％ 、23.3％、20.0％、6.7％。 经χ²检验五种培养基检出率有非常显著差异(P<0.01)4号培养基检出率显著高于其它四种培养基。

2.2 不同血清型 El—Tor霍乱弧菌在4号培养基上检出率比较见表 2。

表 2 不同血清型 El—Tor霍乱弧菌

在 4号培养基上的检出率比较

P<0.11差异无显著性(直接计算法)

3 讨论

3.1 人工污染不同菌量El—Tor霍乱弧菌(6株)的30份大便标本，在4号、庆大、亚胆、双洗、亚洗培养基上的阳性检出率，分别为90.0％、40.0％、23.3％、20.0％、6.7％。实验表明：用4号平板分离El—Tor霍乱弧菌阳性检出率显著高于其它四种培养基。而庆大、亚胆、双洗、亚洗之间的检出率除庆大与亚胆外，其余均无显著差异。

3.2 4号培养基能提高阳性检出率的主要原因是培养基中亚硫酸钠及柠檬酸钠能促进E1一Tor霍乱弧菌的生长。使菌落大而典型；猪胆法(或胆法酸盐)也能促进 El—Tor霍乱弧菌的生长，并有一定的稳定保护作用，减少抑制剂对弧菌的影响；十二烷基硫酸钠作为表面活性 剂能减少培养基的表面张力，使部分杂菌崩解，同时也有利于El—Tor霍乱弧菌的生长：采用亚碲酸钾、庆大霉素及雷佛奴尔作为抑制剂，能抑制在部分的革兰阳性菌及部分肠道革兰阴性菌，相互之间又有协同作用，增加了抑菌谱；因此，在平板中杂菌几乎全部被抑制，E1- Tor霍乱弧菌呈纯培养，致使早期就能在原始划线区检到少数El—Tor霍乱弧菌菌落，从而提高了阳性检出率。

3.3  4号平板分离El-Tot霍乱弧菌有以下几个优点：

3.3.1 菌落典型。即菌落较大，中心黑色，扁平、光滑周围、整齐并且比较透明。容易和其它杂菌鉴别。

3.3.2 抗原性强。El-Tor霍乱弧菌菌落很易挑起乳化，能和霍乱“O”多价血清迅速凝集。

3.3.3 EI-Tor霍乱弧菌不同血清型间的检出率没有显著差异。

3.3.4 检出率高，检出时间短。

实验表明：4号培养基干粉具有配制简便，不需高压，检出快速，阳性率高，抑制杂菌效果好，观察结果方便等优点，实为我们实验室分离El—Tor霍乱弧菌理想的一种培养基。

作者：郑官增

作者单位：台州市疾病预防控制 中心，浙江 318000

参 考 文 献

[1]李影林 主编 ．临 床微生物学 及检验 [M]．吉林 科学技术 出版社， 1991；9：245—253．  ’

[2]卫生部疾病控制司编 ．(第 5版)．霍乱防治手册。1999：48—111．

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