马链球菌兽疫亚种

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ）属于兰氏分群的C群β溶血链球菌，能够感染多种动物及人类。在我国，该菌是猪链球菌病的主要病原，能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及突发性死亡，并对相关从业人员的健康构成潜在威胁。尽管目前国内市场上已有多种预防C群链球菌疫苗，但其免疫保护效果往往不能令人满意，因此安全、高效的新型疫苗仍有待研究。本实验室已采用免疫蛋白组学方法筛选马链球菌兽疫亚种ATCC35246株细胞壁相关蛋白，并成功鉴定出10种免疫原性蛋白。多数蛋白在马链球菌兽疫亚种上未曾见报道，其是否为保护性抗原仍需进一步鉴定。本文根据GenBank上已公布的这10种蛋白的基因序列，分析选择免疫原性较好部分的基因序列设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246株基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出目的基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)、pET-28a(+)中，然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过PCR鉴定和重组质粒双 切鉴定后，挑取阳性克隆菌进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定，目的蛋白均获得良好的表达，大小与预期值一致。Western-blot显示，融合蛋白均可被猪源ATCC35236株康复血清识别，表明其具有天然蛋白的部分抗原性。重组融合蛋白经亲和层析纯化后，与等量ISA206佐剂进行乳化。通过皮下免疫途径分组免疫ICR小鼠，并以ATCC35246全菌灭活苗和PBS作为对照组。用间接ELISA 法检测小鼠血清IgG 抗体，并通过体外调理吞噬试验测定抗血清的调理活性。结果表明重组蛋白免疫小鼠后能有效产生免疫应答，血清中抗体水平有明显升高，且有良好的补体依赖的调理吞噬功能。二免后以5LD50 ATCC35246 强毒株进行腹腔攻击，结果显示试验组存活率优于PBS对照组，其中免疫EF-G融合蛋白组小鼠的保护率达到50%，免疫TF、TK、GAPDH、PPH融合蛋白组均达到37.5%，表明原核表达产物免疫ICR小鼠，可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用，在亚单位疫苗研制中具有应用价值。