生化鉴定试验——酶类试验

1.触酶试验

(1)原理:具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。

(2) 方法:取3 %过氧化氢溶液0.5 时，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1~3 ml 、滴加入盐水菌悬液中。

(3) 结果判断:培养物出现气泡者为阳性(图3 - 37) 。

(4) 注意事项: ①细菌要求新鲜。②因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性，故不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验。③需用已知阳性菌和阴性菌作对照。

2.氧化酶试验

(1)原理:氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C 使对苯二胶氧化，生成有色的酿类化合物。

(2) 方法:取洁净的滤纸一小块，涂抹菌苔少许，加1 滴10 g/ L 对苯二股溶液于菌落上，观察颜色变化。

(3) 结果判断: 立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性(图3 - 38) 。

(4) 注意事项: ①未加抗坏血酸的试剂需每周新鲜配制(试剂在空气中易发生氧化) 。②避免接触含铁物质。③不宜采用含葡萄糖的培养基上的菌落(葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性) 。

3.靛酚氧化酶试验

(1)原理:具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C 氧化，再由氧化型细胞色素C 使盐酸对二甲氨基苯胶氧化，并与α 荼酣结合，生成靛酚蓝而呈蓝色。

(2) 方法:取靛酚氧化酶试纸条，用无菌盐水浸湿后，直接蘸取细菌培养物，立即观察结果。

(3) 结果判断:试纸条在10s 内变成蓝色者为阳性(图3 - 39) 。

4.凝固酶试验

(1)原理: 金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片法测出。另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，能使凝血酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固，可用试管法测出。

(2) 玻片法:取兔或混合人血浆和盐水各l 滴分别置清洁载玻片上，挑取待检菌菌落分别与血浆及盐水混合。如血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象者为阳性(图3 - 40) 。

(3) 试管法:取试管2 支，分别加入0 . 5 ml 的血浆(经生理盐水1:4 稀释) .挑取菌落数个加入测定管充分研磨温匀，用已知阳性菌株加入对照管. 3 7℃水浴3~4 h 。血浆凝固者为阳性(图3-41)。

5. DNA 酶试验

(1)原理: 某些细菌可产生细胞外DNA 酶。DNA 酶可水解DNA 长链，形成数个单核昔酸组成的寡核昔酸链。长链DNA 可被酸沉淀，而水解后形成的寡核昔酸链则可溶于酸，当在菌落平板上加入酸后，若在菌落周围出现透明环，表示该菌具有DNA 酶。

(2) 方法:将待检菌点状接种于DNA 琼脂平板上.3 5℃培养18~24 h. 在细菌生长物上加一层1 mo l/ L 盐酸(使菌落浸没)。

(3) 结果判断: 菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性(图3 - 42) 。

(4) 注意事项: 肠杆菌科中的沙雷菌和变形杆菌可产生DNA 酶，革兰阳性球菌中，只有金黄色葡萄球菌产生DNA 酶，因此可资鉴别。

6 . 硝酸盐还原试验

(1)原理: 硝酸盐培养基中的硝酸盐可被某些细菌还原为亚硝酸盐，后者与乙酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与α 荼胶结合成红色的N-α 荼胶偶氮苯磺酸。

(2) 方法: 将待检菌株接种于硝酸盐培养基， 35℃孵育1~2 日，加入试剂甲液(对氨基苯磺酸和乙酸)和乙液(α 荼肢和乙酸)各2 滴，立即观察结果。

(3) 结果判断: 呈红色者为阳性(图3 - 43) 。若不呈红色，再加入少许辞粉，如仍不变为红色者为阳性，表示培养基中的硝酸盐已被细菌还原为亚硝酸盐，进而分解成氨和氮。加辞粉后变为红色者为阴性，表示硝酸盐未被细菌还原，红色反应是由于辞粉的还原所致。

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