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第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法
6. 检验程序
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 以无菌操作称取样品25g（mL），放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内（或均质杯）内，连续均质1 min～2 min或以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min。液体样品，振荡混匀，制成1:10的样品匀液。
7.1.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
7.1.3 按 7.1.2 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。
7.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色（或ALOA）平板中，用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如琼脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
7.3 培养
7.3.1 在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养24h～48h。
7.4 典型菌落计数和确认
7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在ALOA平板上为蓝绿色菌落,周围有不透明晕圈；在其他李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。
7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在15 CFU～150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a）只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU～150CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b）所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
c）某一稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d）所有稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU～150 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于15 CFU 或大于150CFU 时，应计数最接近15CFU 或150 CFU的稀释度平板上的典型菌落。
以上按公式（1）计算。
f）2 个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU～150 CFU 之间，按公式（2）计算。
7.4.3 从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），分别按5.3、5.4或5.5进行鉴定和确认试验。
8.结果计数
公式（1）：
式中：
T——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；
A——某一稀释度典型菌落的总数；
B——某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
C——某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
d——稀释因子。
公式（2）：
式中：
T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；
A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1——第一稀释度（低稀释倍数）确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
B2——第二稀释度（高稀释倍数）确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
1.1——计算系数；
d ——稀释因子（第一稀释度）。
9.结果报告
报告每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
10 检验程序
11．操作步骤
11.1 样品的稀释
按7.1进行。
11.2接种和培养
11.2.1根据对样品污染状况的估计，选取3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于10 mLLB1肉汤，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过1 mL，则用双料LB1增菌液）于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。每管各移取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，于30 ℃±1 ℃培养24±2 h。
11.2.2 用接种环从各管中移取1环，分别接种李斯特氏菌显色（或ALOA）平板，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。
11.3 确证试验
自每块平板上挑取5个典型菌落（5个以下全选），按照5.3、5.4或5.5进行鉴定。
12 结果与报告
根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（见附录B），报告每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)
A.1.1 成分
胰胨 17.0 g
多价胨 3.0 g
酵母膏 6.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸氢二钾 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.1.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
胰胨 17.0 g
多价胨 3.0 g
酵母膏 6.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸氢二钾 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.2.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3 李氏增菌肉汤(LB1，LB2)
A.3.1 成分
胰胨 5.0 g
多价胨 5.0 g
酵母膏 5.0 g
氯化钠 20.0 g
磷酸二氢钾 1.4 g
磷酸氢二钠 12.0 g
七叶苷 1.0 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.3.2 制法
将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3.2.1 李氏Ⅰ液 (LB1)225 mL中加入：
1 % 萘啶酮酸 (用0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制) 0.5 mL
1 % 吖啶黄 (用无菌蒸馏水配制) 0.3 mL
A.3.2.2 李氏Ⅱ液 (LB2)200 mL中加入：
1 % 萘啶酮酸 0.4 mL
1 %吖啶黄 0.5 mL
A.4 PALCAM琼脂
A.4.1 成分
酵母膏 8.0 g
葡萄糖 0.5 g
七叶甙 0.8 g
柠檬酸铁铵 0.5 g
甘露醇 10.0 g
酚红 0.1 g
氯化锂 15.0 g
酪蛋白胰酶消化物 10.0 g
心胰酶消化物 3.0 g
玉米淀粉 1.0 g
肉胃酶消化物 5.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.4.2 制法
将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.4.2.1 PALCAM选择性添加剂
多粘菌素B 5.0 mg
盐酸吖啶黄 2.5 mg
头孢他啶 10.0 mg
无菌蒸馏水 500 mL
A.4.2.2 制法
将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50 ℃，加入2 ml PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。
A.5 ALOA（Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)琼脂
A.5.1 基础培养基
A.5.1.1 成分
动物组织的酶消化物 18 g
酪蛋白胰酶消化物 6 g
酵母提取物 10 g
丙酮酸钠 2 g
葡萄糖 2 g
甘油磷酸镁 1 g
无水硫酸镁 0.5 g
氯化钠 5 g
氯化锂 10 g
无水磷酸氢钠 2.5 g
5 -溴- 4 -氯-3吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷 0.05 g
琼脂 12 g～18 g(a)
蒸馏水 930 ml （b）
a 按琼脂强度确定
b 如果用两性霉素B为925ml蒸馏水（见A.5.5.2).
A.5.1.2 制法
上述成分进行加热溶解，调pH值7.2 ± 0.2，121°C 高压灭菌15min。
A.5.2 萘啶酮酸溶液
萘啶酮酸钠盐 0.02 g
0.05mol/l的氢氧化钠 5 ml
溶解萘啶酮酸钠于5ml氢氧化钠溶液中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.3 头孢他啶溶液
头孢他啶 0.02 g
无菌蒸馏水 5 ml
溶解头孢他啶于5ml无菌蒸馏水中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.4 多粘菌素B
多粘菌素B硫酸盐 76700 IU
无菌蒸馏水 5 ml
溶解多粘菌素B于5ml无菌蒸馏水中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.5 抗生素添加剂
A.5.5.1 放线菌酮溶液
放线菌酮 0.05 g
乙醇 2.5 ml
无菌蒸馏水 2.5 ml
溶解放线菌酮于2.5ml乙醇溶液中，然后加入2.5ml的无菌蒸馏水混匀。通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.5.2 两性霉素B溶液（可以替代放线菌酮溶液）
两性霉素B 0.01 g
1 mol/l 盐酸（HCl (1 mol/l)） 2.5 ml
二甲基甲酰胺(DMF)） 7.5 ml
溶解两性霉素在盐酸/二甲基甲酰胺溶液中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
注意---盐酸/二甲基甲酰胺溶液有毒，小心使用。
A.5.6 补充剂
溶解2g L-α-磷脂酰肌醇于50 ml蒸馏水中，搅拌30min制成均匀悬浮液。121°C 高压灭菌15min。冷却至48°C～50°C，4°C保存备用。
A.5.7 完全培养基
A.5.7. 1成分
基础培养基 930 ml(a)
萘啶酮酸钠溶液 5 ml
头孢他啶溶液 5 ml
多粘菌素B溶液 5 ml
放线菌酮溶液 5 ml
或两性霉素B溶液 10 ml
补充剂 50 ml
a 如果使用两性霉素B溶液就需要925ml
A.5.7.2 制法
将基础培养基完全溶解，冷却到50 ℃，加入上述各种溶液，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。完全培养基的pH值应为7.2 ± 0.2。
A.6 革兰氏染色液
A 6.1 结晶紫染色液
A.6.1.1 成分
|
结晶紫 |
1.0 g |
|
95％乙醇 |
20.0 mL |
|
1％草酸铵水溶液 |
80.0 mL |
A 6.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
A 6.2 革兰氏碘液
A.6.2.1 成分
|
碘 |
1.0 g |
|
碘化钾 |
2.0 g |
|
蒸馏水 |
300 mL |
A.6.2.2 制法
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。
A.6.3 沙黄复染液
A.6.3.1 成分
|
沙黄 |
0.25 g |
|
95％乙醇 |
10.0 mL |
|
蒸馏水 |
90.0 mL |
A.6.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
A.6.4 染色法
A.6.4.1 涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液，作用1min, 水洗。
A.6.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
A.6.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
A.6.4.4 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。
A.7 SIM 动力培养基
A 7.1 成分
胰胨 20.0 g
多价胨 6.0 g
硫酸铁铵 0.2 g
硫代硫酸钠 0.2 g
琼脂 3.5 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2
A.7.2 制法
将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.7.3 试验方法
挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30 ℃培养24 h～48 h，观察结果。
A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)
A.8.1 成分
多胨 7.0 g
葡萄糖 5.0 g
磷酸氢二钾 5.0 g
蒸馏水 1 000 mL
A.1.1.1 pH 7.0成分
A.8.2 制法
溶化后调节pH，分装试管，每管1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.8.3 甲基红（MR）试验
A.8.3.1 甲基红试剂
A.8.3.1.1 成分
|
甲基红 |
10 mg |
|
95 %乙醇 |
30 mL |
|
蒸馏水 |
20 mL |
A.8.3.1.2 制法
10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL蒸馏水。
A.8.3.1.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中，36 ℃±1 ℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。
A.8.4 V-P试验
A.8.4.1 6 % α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。
A.8.4.2 40 %氢氧化钾溶液
成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。
A.8.4.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中，36 ℃±1 ℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36 ℃±1 ℃继续培养1 h再进行观察。
A.9 血琼脂
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0 g
牛肉膏 0.3 g
氯化钠 0.5 g
琼脂 1.5 g
蒸馏水 100 mL
脱纤维羊血 5 mL～8 mL
A 9.2 制法
除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 ℃高压灭菌15 min，冷到50 ℃，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。
A.10 糖发酵管
A.10.1 成分
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨 10.0 g
氯化钠 3.0 g
磷酸氢二钠(Na2HPO4×12H2O) 2.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL
蒸馏水 1 000 mL
A.10.2 制法
A.10.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5 %比例加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，调节pH至7.4，115 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.10.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL，115 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
A.10.3 试验方法
取适量纯培养物接种于糖发酵管，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳性。
A.11 过氧化氢酶试验
A.11.1 试剂
3%过氧化氢溶液：临用时配制。
A.11.2 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内，,滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。
A.11.3 结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
A.12. 缓冲蛋白胨水（BPW）
A.12.1成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0 g
磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 9.0 g
磷酸二氢钾 1.5 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2
A.12.2. 制法
加热搅拌至溶解,调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。
附录B
（规范性附录）
单核细胞增生李斯特氏菌最可能数（MPN）检索表
B.1 每g(mL)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数（MPN）
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