中国科学院微生物所于波团队Trends in Biotechnology综述丨非常规酵母：有机酸发酵的优良底盘细胞

  有机酸发酵菌株耐酸性差，发酵过程添加的碱性物质导致的废盐再处理成本高是有机酸产业发展的瓶颈问题。非常规酵母由于天然具有理想细胞工厂所需的高鲁棒性、宽底物利用能力等优异特性而逐渐成为有机酸生物制造的核心组成部分。

  中国科学院微生物研究所的于波研究员团队在Cell Press细胞出版社期刊Trends in Biotechnology 发表了题为“Non-conventional yeasts: promising cell factories for organic acid bioproduction”的综述。该文的通讯作者为王丽敏项目研究员，于波研究员。该文总结和阐述了非常规酵母的环境适应性特征，以及非常规酵母菌基因组遗传操作工具的开发。此外，该文还以在工业上广泛应用的C3、C4、以及C6有机酸为实例，系统阐述了非常规酵母在有机酸生产中的进展与挑战。

非常规酵母：新一代有机酸生产优良底盘细胞

  有机酸是在食品、化工、农业和制药等行业具有广泛应用的平台化合物， 2021年全球有机酸市场估计为235亿美元，预计到2028年其市场规模将达到261亿美元。微生物发酵法已实现了大规模生产包括乳酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸等20多种有机酸。目前，微生物发酵法生产有机酸面临的重大挑战之一是积累的产物对生产菌株的抑制作用。有机酸工业化生产的浓度对大多数有机酸工业生产菌株具有抑制性，中和剂的添加不可避免地增加了有机酸的生产成本，并使下游产品的提取变得复杂。大多数酵母菌具有耐受性强、生长繁殖快等优点被用作生物基化学品发酵的首选微生物之一。非常规酵母（即未在实验室规模研究中广泛使用和/或在工业规模化生产中不常用的酵母菌）由于其具有天然的工业适应性逐渐成为学者们研究的热点。比如，库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）可以在低pH条件下生成产物，大大降低中和剂的添加，解决了有机酸生产过程中碱性副产物添加带来的下游提取成本高、环境污染等问题（见图一）。

非常规酵母作为有机酸生产底盘细胞至关重要的特性

非常规酵母在特定环境中经过长期的自然进化而获得耐高温、耐酸等优良特性，这些天然的鲁棒性使非常规酵母成为了非常有潜力的生物基化学品生产菌株，是下一代有机酸生产理想的底盘细胞。

1. 环境适应性强

有机酸生产需要环境适应性强的生产菌株，为了实现这一目标，性状优良的非常规酵母菌株的筛选与获得至关重要。高通量的筛选方法，结合适应性进化技术可以提高菌株在胁迫条件下的生长性能。迄今为止，学者们已经对少数非常规酵母进行了表征，完成了菌株Komagataella phaffii （P. pastoris），Yarrowia lipolytica， Ogataea polymorpha，K. marxianus，以及P. kudriavzevii（Issatchenkia orientalis）的全基因组测序，并开发了基因组编辑工具，以满足代谢改造的需要。 

2. 非常规酵母耐酸机制

有机酸发酵过程中，产物有机酸浓度的增加会导致环境pH降低，从而造成毒性，破坏细胞内稳态，影响脂质组织和细胞膜。转运蛋白在调节底物转入和产物转出的过程中发挥着至关重要的作用，Zygosaccharomyces bailii中特有的基因ZbYME2赋予该菌具有耐受苯甲酸和山梨酸的能力。非常规酵母细胞膜中高含量的多不饱和脂肪酸（PUFA）有助于增加膜流动性，帮助它们适应外部压力。此外，液泡中的蛋白质降解和再循环已被证明是酵母在己二酸中存活的重要生物过程（见图2）。 

非常规酵母基因组编辑的挑战

大多数非常规酵母不是天然的有机酸生产者，高效的基因组编辑系统的开发对于构建有机酸生产途径是不可或缺的。非常规酵母有一些遗传局限性，例如存在控制生产表型的未确定特征的多因子调控，非同源末端连接（NHEJ）和同源末端修复（HR）的DNA修复机制，以及无法将某些代谢特征转移到多个宿主。已经开发了Y. lipolytica，K. phaffii ，K. marxianusa的合成生物学（SynBio）工具包，提高外援DNA的整合效率。CRISPR/Cas9，CRISPR interference （CRISPRi），CRISPR activation（CRISPRa），以及多基因整合的工具包YaliCMulti和YaliHMulti已经在某些非常规酵母菌中开发，但是缺少通用的基因组编辑工具的开发。

非常规酵母生产工业应用的有机酸代谢工程改造

以非常规酵母为底盘，通过代谢工程改造已经获得了生产不同种类有机酸的基因工程菌株（见图3）。

1. C3有机酸（乳酸、3-羟基丙酸）代谢工程改造

微生物发酵法是乳酸的工业化生产方法，通过阻断酵母乙醇合成途径，引入乳酸代谢途径，已经构建了多株L-乳酸或者D-乳酸生产的非常规酵母工程菌。以P. kudriavzevii为出发菌株，基因工程改造的菌株D-乳酸产量可以达到135-154 g/L。构建的产L-乳酸的P. kudriavzevii基因工程菌株，在无中和剂的条件下L-乳酸产量达到75 g/L，为乳酸的清洁生产奠定了基础。3-羟基丙酸（3-HP）的市场规模预计每年将达到100亿美元，传统的微生物生产方法依赖辅酶B12。Rhodosporidium toruloides、Y. lipolytica 已经被代谢改造，利用甘油或者纤维素水解液生产3-HP。

2. C4有机酸（苹果酸、琥珀酸、富马酸）代谢工程改造

苹果酸、琥珀酸和富马酸被美国能源部列为12种最常见的重要平台化学品。P. kudriavzevii基因工程菌株可以利用葡萄糖生成199 g/L的L-苹果酸，发酵终pH为3.1。P. kudriavzevii和Y. lipolytica 已经被代谢改造利用葡萄糖、甘油、木糖、或者甘蔗汁为原料生产琥珀酸，最高产量达到198 g/L。虽然Aureobasidium pullulans、Candida glabrata、以及Scheffersomyces stipitis被代谢改造在pH 5.5左右生产富马酸，但是由于酵母来源的延胡索酸酶对富马酸低亲和性，导致富马酸产量较低，还需进一步优化合成途径。

3. C6有机酸（己二酸、己酸、柠檬酸）代谢工程改造

己二酸是尼龙生产的前体，年市场需求量约为300万吨，其工业生产方法为化学合成法。Candida tropicalis和P. occidentalis具有天然的己二酸耐受性，其代谢改造的菌株可以在低pH条件下生产己二酸。己酸是一种线性羧酸，在食品、药品和化妆品具有广泛应用，天然的己酸生产菌株为厌氧菌。针对己酸对酵母菌具有较强抑制作用这一问题，利用适应性进化技术提高了Y. lipolytica的己酸耐受性，驯化的菌株可以耐受6 g/L己酸。传统的柠檬酸发酵存在氧气消耗量大以及菌丝体聚集等问题，Y. lipolytica被代谢改造生产柠檬酸，产量达到200 g/L。

总结与展望

非常规酵母天然的高鲁棒性及宽底物利用能力有望成为新一代有机酸生产底盘细胞，但是仍有几个挑战需要解决：一是有限的非常规酵母基因组背景表征；二是缺少高效的基因组操作工具，特别是多位点整合工具欠缺；三是与有机酸工业生产菌株相比，大多数非常规酵母的产量和转化率还需进一步提高。除了独特的特性以外，一些非常规酵母的条件致病性在微生物细胞工厂开发的过程中也要适当的考虑。

来源：CellPress细胞科学

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