出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export 1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 　　本标准适用于出口食品的检验。 2　设备和材料 2.1　吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2　水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3　培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4　冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。 2.5　均质器。 2.6　乳钵和研棒。 2.7　平皿：直径90mm。 2.8　天平：感量0.1g。 2.9　显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3　培养基及试剂 3.1　月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2　煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。 3.4　伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5　营养琼脂斜面。 3.6　色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9　结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10　Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。 4　样品制备 4.1　以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。 4.2　不同食品样品匀液的制备 4.2.1　液体食品 以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠), 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。 4.2.2　固体和半固体食品 　　以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.3　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 5　大肠菌群的测定 5.1　大肠菌群MPN值的测定 5.1.1　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 5.1.2　将接种管置于36±1℃培养48±2h。 5.1.3　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。 5.2　大肠菌群的证实试验 5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。 5.2.2　置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 5.2.4　结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。 6　粪大肠菌群测定 6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 6.3　记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。 6.4　结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。 7　大肠杆菌测定 7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 7.3　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 7.4.1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长 。 7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 7.4.5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下： 靛 基 质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定(型别) ＋ ＋ － － 典型大肠杆菌 － ＋ － － 非典型大肠杆菌 ＋ ＋ － ＋ 典型中间型 － ＋ － ＋ 非典型中间型 － － ＋ ＋ 典型产气肠杆菌 ＋ － ＋ ＋ 非典型产气肠杆菌 　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做 重复试验。 7.5　结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋ －－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。 8　大肠菌群固体培养基测定法 8.1　样品制备同第4章。 8.2　计数 8.2.1　选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。 8.2.2　将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。 8.2.3　待琼脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆盖平板表层。 8.2.4　翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。 8.2.5　选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。 8.2.6　证实 8.2.6.1　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。 8.2.6.2　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。 8.2.7　结果报告 　　经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。 　　例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为： 　　100×6/10×10**-4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL) (补充件) 使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。 阳 性 管 数 阳 性 管 数 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0 0 0 ＜3 2 0 0 9.1 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6.1 2 1 1 20 0 1 2 9.2 2 1 2 27 0 2 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6.2 2 2 0 21 0 2 1 9.3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9.4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3.6 3 0 0 23 1 0 1 7.2 3 3 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 73 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 >1100 注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。 　 ②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。 附加说明: 　　本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。 　　本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。 　　本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。 　　本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。 中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施