沙 门 氏 菌 检 测 FDA分析手册(2003年3月) 第5章 章节内容 1、 简介 2、 设备和材料 3、 培养基和试剂 4、 样品的制备 5、 沙门氏菌的分离培养 6、 沙门氏菌的鉴定 7、 快速检测方法(附录1) 8、 参考文献 简介 在第8版的BAM手册中，沙门氏菌的检测方法有了几个改变。 第一个改变是RV培养基的广泛使用，即可用于检测含沙门氏菌量高的食品，又可于检测含沙门氏菌量低的食品，以前的版本中，RV培养基仅用于虾类的检测。依据AOAC反复研究的结果，RV培养基即可用于检测含沙门氏菌量高的食品，又可于检测含沙门氏菌量低的食品。除口香糖外的所有食品，RV培养基替代了SC培养基。此外，RV培养基取代了必须含有活性干酵母的LST肉汤培养基。TTB肉汤继续用于第二种选择性增菌培养基，包括口香糖在内的食品，在检测含菌量高的食品时需进行43℃培养；在检测含菌量低的食品时需进行35℃培养。 第二个改变是对于冷藏食品前增菌和低水份食品选择性增菌培养的时间为72小时以内，这样，样品检测的时间最迟星期三或星期四可以开始，周末也不用加班。 第三个改变是缩短了在LIA斜面上的培养时间，在以前的版本(BAM-7)中，TSI和LIA斜面在35℃培养的时间分别为24±2h和48±2h。未公布的一些资料表明，48小时后观察LIA斜面结果是没有任何诊断价值。对193个LIA斜面进行试验，培养24±2h后，所有的斜面都给出了正确的结果。再培养24h后，试验的结果没有什么重大的改变。所以，TSI和LIA斜面培养基现在改为培养24±2h。 第四个改变是蛋壳表面灭菌步骤的改变。在以前的版本(BAM-7)中，蛋壳表面灭菌的方法是在0.1%的HgCl2溶液中浸泡1h，然后在70%的乙醇溶液中浸泡30分钟。HgCl2对人体是有害的，依据环境保护组织的要求进行处理，费用是非常昂贵的。在新版的手册（BAM-7）中，蛋壳表面的消毒只需通过浸泡在含0.1%SDS的次氯酸钠溶液(含Cl-200PPM)中30分钟。 第五个改变是蛋类样品的制备。在检测前，蛋的内容物(蛋黄和蛋白)需进行完全混匀。之后，取25ml加入含硫酸铁的胰酪胨大豆肉汤中。 本版中，制定了口香糖的检测方法。口香糖样品和增菌肉汤以1：9的比例进行混合，得到的混合物非常粘，不易被吸管吸出。另外添加纤维素酶时，容易被吸管吸出。 由于最近桔子汁相关事件的发生，其检验方法也己制定出，被检的桔子汁包括经巴氏消毒和未经巴氏消毒的。 从选择性平板上挑菌落说明更明白和科学。如果在选择性平板上没有可疑的典型菌落，建议挑取几个非典型菌落接种到TSI和LIA培养基上。由于在过去的几年里，FDA的科学家们从一些食品中，特别是从海产品中分离出沙门氏菌，其中4%左右在选择性平板是非典型菌落。 最后，自成BAM-7发行以来，已经制定出6种培养基的使用说明。包括3种选择性培养基（BS琼脂、HE琼脂和XLD琼脂）和3种比较新的培养基(EF-18、XLT、Rambach 琼脂)。我们的实验结果证实，用一种或几种新的培养基来取代BAM中推荐的培养基是不理想的。因些，我们一直保留下来。 A、设备和材料 1、 搅拌器和无菌搅拌杯 2、 无菌500ML广口螺口三角瓶、无菌500ML长颈三角瓶、无菌250ML烧杯、无菌玻璃漏斗、无菌采样器 3、 无菌玻璃涂布捧或塑料涂布捧 4、 电子天平，精度0.1g，最大量称2000g 5、 电子天平，精度5mg，最大量称120g 6、 培养箱：35±2℃ 7、 冰箱：4±2℃ 8、 水浴箱：49±1℃ 9、 循环的、温度可调的水浴箱：43±0.2℃ 10、循环的、温度可调的水浴箱：42±0.2℃ 11、无菌药匙或其它合适的工具：用于称样品 12、无菌培养皿：15X100MM，玻璃或一次性的 13、1ml无菌吸管,刻度0.01ml、5ml和10ml无菌吸管,刻度0.1ml 14、接种针和接种环 15、无菌试验试管或培养试管：16X150MM和20X150MM 血清学鉴定管：10X75MM或13X100MM 16、试管架 17、旋转混合器 18、无菌剪刀、大剪刀、解剖刀及镊子 19、灯：用于观察生化反应 20、电炉 21、PH试纸：PH值6-8，最大变色范围在0.4PH单位 22、PH计 23、28X37CM的无菌塑料袋，易拉口(在第23-24节中，检测蛙腿和兔体时用) 24、塑料烧杯：能耐高温高压，用于振荡培养过程中，固定塑料袋 B、培养基和试剂 1、 乳糖肉汤(M74) 2、 脱脂奶粉(M111) 3、 SC肉汤(M134) 4、 TTB肉汤(M145) 5、 RV培养基(M132) 6、 XLD琼脂(M179) 7、 HE琼脂(M61) 8、 BS琼脂(M19) 9、 TSI琼脂(M149) 10、色氨酸肉汤(M164) 11、胰酪胨大豆肉汤(M154) 12、含硫酸铁的胰酪胨大豆肉汤(M186) 13、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(M76) 14、胰酪胨示胨大豆肉汤(M160) 15、MR-VP肉汤(M104) 16、西蒙氏枸橼酸盐培养基M138 17、尿素肉汤(M171) 18、尿素肉汤(快速)(M172) 19、丙二酸钠培养基(M92) 20、LIA培养基(M89) 21、赖氨酸脱羧酶肉汤(M87) 22、动力培养基(M103) 23、KCN培养基(M126) 24、苯酚红糖类发酵肉汤(M121) 25、紫色糖类发酵肉汤(M130) 26、麦康凯琼脂(M91) 27、营养肉汤(M114) 28、BHI肉汤(M24) 29、5%木瓜蛋白酶溶液(M56a) 30、1%纤维素酶溶液(M187) 31、月示胨羊血琼脂基础(M166) 32、通用前增菌肉汤(UPM,M188) 33、无水亚硫酸钾粉末 34、200ppm次氯酸钠溶液，含0.1%SDS(R12a) 35、70%乙醇溶液(R23) 36、靛基质试剂(R38) 37、V-P试剂(R89) 38、肌酸晶体 39、40%KOH溶液(R65) 40、1N NaOH溶液(R73) 41、1N HCl溶液(R36) 42、1%煌绿溶液(R8) 43、溴甲酚紫溶液,0.2%(R9) 44、甲基红指示剂(R44) 45、无菌蒸馏水 46、Tergitol-7(R78) 47、Triton X-100(R86) 48、0.85%生理盐水(R63) 49、适当浓度的生理盐水(R27) 50、沙门氏菌多价O血清 51、沙门氏菌多价H血清 52、沙门氏菌多价O群血清：A、B、C1、C2、C3、D1、D2、E1、E2、E3、E4、F、G、H、I、Vi和其它相应血清 53、沙门氏菌Spicer-Edwards H血清 C、样品制备 以下的方法均以25g样品作为抽检单位，样品与肉汤培养液的比例为1:9。根据样品的组成成份不同，添加足够的肉汤培养基保持1:9的比例，除非特殊说明，例如，蛙腿等不需准确称量检测的样品，需采用特殊的方法。 1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液体牛奶(脱脂牛奶、含2%脂肪牛奶、全牛奶和脱脂奶粉)，粉状调制食品(蛋糕、甜饼、炸面圈、饼干和面包)、婴儿食品、口食或软管进食的含蛋食品。 检验前的冷冻食品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化来获得待检部分，尽可能 缩短解冻的时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤。解冻需在45℃以下进行，置于能自动控温的水浴锅内，不断搅拌15分钟或在2-5℃解冻18小时。无菌称取25克样品，放入无菌带螺旋帽的广口瓶中(500ML)或其它合适的容器内。对于非粉末状的样品，加入225ml无菌的乳糖肉汤；对于粉末状的样品，先加入约15ml无菌的乳糖肉汤，用无菌的玻璃捧、药匙或舌状器具搅拌，使其均匀悬浮，再加入3份无菌乳糖肉汤，分别为10ml、10ml和190ml,使总量为225ml。充分搅拌，直到样品完全悬浮，没有块状物。小心地盖紧瓶盖，室温静置60±5min。振荡混匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈，置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 2、蛋类 a、 含壳蛋。用硬刷子洗蛋并使其干燥，然后浸泡于含0.1%SDS的200ppm 氯离子溶液中30分钟。此溶液的配制如下：取8ml 5.25%的次氯酸钠溶液和1gSDS加入992ml蒸馏水中溶解即可。这种消毒液需在使用前配制。无菌打开蛋壳置于无菌的容器内，用无菌的药匙或其它工具混合蛋清和蛋黄。无菌称取25g于无菌的三角瓶中或其它合适的容器内，加入225ml含硫酸铁的TSB肉汤(1L TSB中加入35mg硫酸铁)，混匀，室温静置60±5min。振荡混匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 b、液全蛋（均匀状）。无菌称取25g于无菌的三角瓶或其他适宜的容器内，加入225ml含硫酸铁的TSB充分摇匀，按上面的方法继续。 c、 煮硬的蛋（鸡蛋、鸭蛋或其他种类的蛋）。如果蛋壳完整，向上述方法进行消毒，无菌分离蛋壳，弄碎蛋黄和蛋白，称取25g与无菌的500ml的锥形瓶中或其他的容器内，加入225mlTSB，并且摇匀，按上述方法继续。 3、脱脂干奶粉 a、 速溶型。无菌称取25g样品于无菌的烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的煌绿水的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使样液覆盖在煌绿水的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例煌绿水的容器内，使样品覆盖在煌绿水的表面，按每1000ml灭菌蒸馏水中加入2ml2%的煌绿溶液进行配制，将样品容器室温静置60±5min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35℃培养24±2h，按D1-11继续。 b、 非速溶。按上述速溶脱脂干奶粉的检测方法进行，但不允许将多个25g样品检测单位混合。 4、全脂奶粉。按上述速溶脱脂干奶粉的检测方法进行，但不允许将多个25g样品检测单位混合。 5、酪蛋白 a、 乳酪。无菌称取25g样品于无菌的250ml烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的普通肉汤的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使其覆盖在普通肉汤的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例普通肉汤的容器内，使样品覆盖在普通肉汤的表面，将样品容器室温静置60±5min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35℃培养24±2h，按D1-11继续。 b、 凝乳酪。无菌称取25g样品于无菌的250ml烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的乳糖肉汤的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使其覆盖在乳糖肉汤的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例乳糖肉汤的容器内，使样品覆盖在乳糖肉汤的表面，将样品容器室温静置60±5min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35℃培养24±2h，按D1-11继续。 c、 咸乳酪。无菌称取25g样品于无菌的带螺旋帽的广口瓶中或其他合适的容器内，添加225ml无菌的乳糖肉汤并且混匀，多个25g样品检测单位可以混合，旋紧瓶塞，室温下静置60±5min，然后摇匀，用PH试纸检测PH，如果必要调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈，置于35℃培养24±2h。以下试验接D,1-11进行。 6、豆粉。按上述凝乳酪和咸乳酪的方法进行检测，但多个25g样品不能混合。 7、含蛋制品(面条、蛋卷、空心粉、意大利面条)、干酪、面团、调制色拉(火腿、蛋、鸡肉、金枪鱼、火鸡)、新鲜的、冷冻的或干的水果和蔬菜、果仁和甲壳类动物(小虾、蟹、小龙虾、大虾、大龙虾)和鱼。 检测前最好不要解冻，如检测样品必须解冻，需在45℃以下进行，置于能自动控温的水浴锅内，不断搅拌15分钟或在2-5℃解冻18小时。 无菌称取25克样品，放入无菌的均质器内。加入225ml无菌的乳糖肉汤均质2 分钟。再无菌转移均质混合物于无菌的广口的带有旋螺帽的锥型瓶或其它合适的容器中，盖紧瓶盖，室温静置60±5min。振荡混匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 8、干酵母(活性和无活性酵母) 无菌称取25g样品于灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500ml)或其它合适的容器内，加 入225ml灭菌的胰酪胨大豆肉汤，充分混匀形成悬液，盖紧瓶塞，室温下静置60min。摇匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 9、冷冻和高级混合食品 无菌称取25g样品于灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500ml)或其它合适的容器内，加 入225ml灭菌的营养肉汤，充分混匀形成悬液，盖紧瓶塞，室温下静置60min。摇匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 10、调料 a、 黑胡椒、白胡椒、芹菜种子或芹菜叶片、干辣椒粉、红辣椒、茴香、皱叶欧芹片、迷迭香、芝麻、百里香和蔬菜片。无菌称取25g样品于灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500ml)或其它合适的容器内，加 入225ml灭菌的TSB肉汤，充分混匀形成悬液，盖紧瓶塞，室温下静置60min。摇匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 b、 洋葱片、洋葱粉和大蒜片。无菌称取25g样品于灭菌的带螺旋帽的广口瓶或其它合适的容器内，样品的前增菌培养基用含K2SO4的TSB肉汤(1000mlTSB肉汤中加入5g K2SO4，最终浓度为0.5%)，将K2SO4加入TSB肉汤中，分装每瓶225ml，121℃高压灭菌15min，灭菌后，无菌测定其容量。如果必须，调整容量至225ml，将225ml含有K2SO4的TSB加入样品中混匀，以下按C-10a进行。 c、 多香果粉、肉桂、丁香及薄荷调味料 目前还没有方法可以中和这4种调料的毒性。将它们稀释至无毒的程度后，再进行检测。检测多香果粉、肉桂和薄荷时，样品与肉汤的比例为1:100，而丁香与肉汤的比例为1:1000；检验叶状调味品时，由于是脱水产品，可吸收部分肉汤，在实际检测中样品与肉汤的比例大于1:10，检测这些调味品时，按以上C-10a进行，保持推荐的样品与肉汤的比例。 11、密饯和糖衣(包括巧克力) 无菌操作称取25g样品于灭菌的搅拌器内，加入225ml重溶的脱脂奶粉，搅拌2分钟，再无菌操作移取样品液到灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500ml)或其它合适的容器内，盖紧瓶塞，室温下静置60±5min。摇匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。加入0.45ml1%亮绿水溶液，混匀，把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 12、椰子 无菌操作称取25g样品于灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500ml)或其它合适的容器内，盖紧瓶塞，室温下静置60±5min。摇匀的搅拌器内，加入225ml乳糖肉汤，搅拌2分钟，再无菌操作移取样品液到，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.8±0.2。加入2.25ml已蒸过的Tergitol-7溶液，混匀。也可用已蒸过的Triton-100。这些表面活性剂要使用最少的量，刚好产生气泡。Triton-100滴上2-3小滴即可。把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,1-11进行。 13、食品染料和食品色素 PH值6.0或以上的染料(10%的水悬浮液)，按上述干全蛋方法(以上C-1法)进行检测。沉淀染料或PH值低于6.0的染料，无菌操作称取25g样品，放入灭菌的带螺旋帽的500ml广口瓶内，加入225ml不含煌绿的TTB肉汤混匀，盖紧瓶塞，室温下静止60±5min。用PH计调整PH值至6.8±0.2，加入2.25ml 1%的煌绿溶液，摇匀，把瓶盖松开约1/4圈置于35℃培养24±2h。以下试验按D,3-11进行。 14、明胶 无菌操作称取25g样品，放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤和5mL5%明胶酶水溶液。混合均匀，盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。将瓶盖旋松1/4转，置35℃培养24±2小时。以下试验按D,1-11进行。 15、肉、肉代用品、肉副产品、动物产品、腺体制品和粗粉（鱼，肉，骨） 无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤，搅拌2分钟。再无菌操作转移已搅拌的混合物到灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。如果混合物为粉状，研磨过或已粉碎的，则不用搅拌。不需要搅拌的样品，加入乳糖肉汤，并充分混匀；盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。旋动使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过（15分钟）的Tergitol-7，混匀。也可用已蒸过（15分钟）的Triton-100来代替。控制使用这些表面活性剂剂量，刚刚起泡沫即可。实际用量取决于试验材料的成分；分析粉状腺体制品，不需要用表面活性剂。将瓶盖旋松1/4转后，将样品混合物置35℃培养24±2小时。以下试验按D,1-11进行。 16、田鸡腿（此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验） 将15对田鸡腿放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没，其比例样品比乳糖肉汤为1:9(见以上A，23-24)。如果单个腿估计平均重在25g或以上，则只需检查15对的每对中的一条腿。把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械荡器上震荡15min，以4cm（1-1/2in）机械振荡100次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内。加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温下静置60分钟。必要时调节pH值至6.8±0.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内，于35℃培养24±2小时。接下去按下面的D，1-11进行。 17、野兔骨架（此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架） 取3只野兔骨架放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没，其比例：样品比乳糖肉汤为1:9(见上述A，23-24)，把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械震荡器上以4cm（1-1/2in）幅度振荡100次/分钟，震荡15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内，加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温静置60分钟。必要时用pH试纸调置6.8±0.2，于35℃培养24±2小时。接下去按下面D，1-11进行。 18、口香糖 无菌操作称取25g样品到灭菌烧杯（250mL）或其他合适容器中。制备过滤除菌的1.0%纤维素酶溶液（加1g纤维素酶到99mL无菌水中），用0.45um膜过滤除菌，置于150mL瓶中。（纤维素酶溶液在2-5℃可保存最长2周时间）。加入225mL无菌乳糖肉汤和2.25mL无菌1%纤维素酶溶液于500mL无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器。用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时，通过无菌玻璃漏斗迅速倒入25g待检样品。旋好瓶盖，室温下静置60分钟，无须调pH值。旋松瓶盖，35℃培养24±2小时。以下按D，1-11进行。 19、桔子汁、苹果汁(经巴氏消毒或未经巴氏消毒)和果酒(经巴氏消毒) 无菌称取25ml样品加入到含有225mlUPB肉汤中，放入灭菌的带螺旋帽的500ml广口瓶内或其它合适的容器内，盖紧瓶塞，充分摇匀，室温下静止60±5min。不用调PH值，旋松瓶盖，35℃培养24±2小时。以下按D，1-11进行(按低含量微生物进行处理)。 20、猪耳和狗颚类 从每个样品中挑出一片(尺寸小的可挑2-3片)置于无菌的塑料袋中，将塑料袋置于大烧杯中或其它合适的容器内，按1:9的比例(g/L) (见以上A，23-24)加入无菌的乳糖肉汤，浸没样品。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。旋动使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。加入0-1%已蒸过（15分钟）的Tergitol-7或已蒸过（15分钟）的Triton-100来代替。控制使用这些表面活性剂剂量，刚刚起泡沫即可。例如，225ml乳糖肉汤加入最大体积为2.25ml。将样品混合物置35℃培养24±2小时。接下来的试验按D,1-11进行。 D、沙门氏菌的分离培养 1、 拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。 口香糖：吸取1ml样品液到10ml的SC肉汤中，另取1ml样品液到10ml TTB肉汤中，混匀。 所有其它食品：吸取0.1ml样品液到10ml的RV培养基中，另取0.1ml样品液到10mlTTB肉汤中，混匀。 2、 选择性增菌按如下步骤进行： 含菌量高的食品：RV培养基在42±0.2℃（水浴、循环的、温度可调）中培养24±2小时。TTB肉汤在43±0.2℃（水浴、循环的、温度可调）中培养24±2小时。 含菌量低的食品(口香糖除外)：RV培养基在42±0.2℃（水浴、循环的、温度可调）中培养24±2小时。TTB肉汤在35±2℃（水浴、循环的、温度可调）中培养24±2小时。 口香糖：SC和TTB肉汤在35℃培养24±2小时。 3、 混合均匀（如果是试管，涡旋式混合），用3mm直径的接种环，满环（10μl）划线接种TTB肉汤于亚硫酸铋（BS）琼脂，XLD琼脂和HE琼脂平板上。BS琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处。 4、 再用3mm直径的接种环，从RV培养基（样品为含菌量高的食品和菌量高的食品）和SC肉汤（样品为口香糖）取满环（10μl），划线接种于上述平板上。 5、 参考官方检测方法994.04，对于冷藏食品的前增菌和低水份食品的选择性增菌(仅SC和TTB肉汤)方法。这样样品的检测最迟可从星期四开始，周末不用加班工作。 6、 把选择性平板置35℃培养24±2小时。 7、 检查平板中可疑沙门氏菌菌落的存在。 典型的沙门氏菌菌落形态： 从每个经过24±2小时培养后选择性平板上挑取2个或更多个菌落。典型的 沙门氏菌菌落如下： a、 在HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上。菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。 b、 在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上. 粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落。 c、 亚硫酸铋（BS）琼脂上。呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。 如果典型菌落出现在经24±2小时培养后的BS琼脂上，则挑取2个或更多个典型菌落。不论BS琼脂平板在培养24±2小时时是否挑取过菌落，BS平板再培养24±2小时。培养了48±2小时后，如果BS平板上出现典型菌，则挑取2个或更多个菌落，如果只在经过24±2小时培养的BS平板上挑取了菌落，接种到三糖铁琼脂（TSI）和赖氨酸琼脂（LIA）上，会呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌 。参见下面D.8部分和D.9部分，有关TSI和LIA反应的详细描述。 非典型的沙门氏菌菌落形态: 不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。 a. HE和XLD琼脂. 非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。 b. BS琼脂.某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。 参考的对照培养物 除了阳性对照外（典型沙门氏菌），3个附加的沙门氏菌培养物也可用来辅助非典型沙门氏菌在选择性平板上的获得，这些对照是乳糖阳性，H2S阳性的沙门氏菌（ATCC12325）和乳糖阴性，H2S阴性的沙门氏菌（ATCC9842），或者乳糖阳性，H2S阴性的沙门氏菌（ATCC29934），这些菌种可从ATCC购买到。 8、 用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，即可接种LIA斜面，先穿刺接种底层两次，再划线斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧条件，因而LIA斜面必须有深的底层（4cm）。将已挑过菌落的选择性平板于5-8℃储存。 9、 将TSI和LIA琼脂斜面于35℃分别培养24±2小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件，以防止过量的H2S产生。在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），产生或不产生H2S（琼脂变黑色）。在LIA琼脂中，典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性（紫色）反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性（阴性）反应。不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA中，大多数沙门氏菌培养物皆产生H2S；一些非沙门氏菌培养物产生砖红色反应。 10、 在LIA琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物，无论其在TSI琼脂上反应如何，皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物，并进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层反应和在TSI中呈斜面碱性，底层酸性的培养物，均视为可疑的沙门氏菌分离物，应进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层和在TSI中呈酸性斜面和酸性底层的培养物，可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性TIS琼脂培养物，可按下面四，11节叙述的进行检测，是否为沙门氏菌，包括亚利桑那沙门氏菌。如果TSI中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应（斜面碱性，底层酸性），再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四，8节所述的接种TSI和LIA斜面。 11、 生化和血清学鉴定试验： a. 从RV培养基（或口香糖中亚硒酸盐胱氨酸肉汤）划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划线分离的选择性平板所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物，进行生化和血清学鉴定试验。 b. 如从一组选择性琼脂平板未分离出3个拟定阳性的TSI琼脂培养物，则对其它已分离到的拟定阳性的TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。对所分析的每个25g样品，至少应检查6个TSI培养物。 E、沙门氏菌的鉴定： 1、 混杂培养物. 对呈混杂菌的TSI琼脂培养物，皆应划线接种于麦康凯（MC）琼脂，HE琼脂，或木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上，于35℃培养24±2小时。检查平板上可疑沙门氏菌存在与否。 a. 在麦康凯（MC）琼脂上：典型菌落呈透明、无色，有时带有暗色中心。沙门氏菌菌落有时可使培养基中其它细菌所造成的胆盐沉淀区透明。 b. 在HE琼脂上：见上述四，7a c. 在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上：见上述四，7b. 按上面的四，7节所述转种至少2个可疑沙门氏菌菌落到TSI琼脂和LIA琼脂斜面上，接下去按上述的四，9节进行鉴定. 2、 纯培养物： a、 尿素酶试验（常规）。由每个拟定阳性TSI琼脂斜面培养物，用灭菌针分别接种生长物到每个尿素肉汤试管中。偶尔也会有未接种的尿素肉汤管变紫红色（试验阳性），因而应包括未接种该肉汤管作为对照，于35℃培养24±2小时。 b、 可选的尿素酶试验（快速法）。用3mm直径接种环，自每一拟定阳性的TSI琼脂斜面培养物中取2环转种到快速尿素肉汤管中，37±0.5℃水浴中培养2小时。弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有阴性反应的（培养基不变色）培养物，为进一步研究试验用。 3、 血清学多价鞭毛（H）试验： a、 此时或以后进行多价鞭毛（H）试验，可按下面五，4节所述进行。从每个尿素酶阴性的TSI琼脂斜面培养物接种到以下任一项， 1）脑心浸液肉汤，于35℃培养4�6小时，直到可见的生长物出现（供当日试验用），或2）胰胳胨大豆肉汤，于35℃培养24±2小时（供次日试验用）。在各5mL肉汤培养物中加2.5mL甲醛生理盐水溶液。 b、 选两个以甲醛处理的肉汤培养物同沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清试验。在10×75mm或13×100mm血清学试管内，加入0.5mL经合适稀释的沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清，再加入0.5mL待测抗原进行试验。并以0.5mL甲醛生理盐水溶液同0.5mL甲醛处理的抗原混合好，制成盐水对照，将各混合物于48-50℃水浴培养，每隔15分钟观察一次初步结果，并于1小时读数最终结果。 阳性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中凝集，而在甲醛肉汤培养物与甲醛盐水管中（对照管）不凝集。 阴性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中（试验混合物）不凝集，在对照管中也不凝集。 非特异反应：在试验混合物与对照管中皆出现凝集。对出现这类结果的培养物，需用“Spicer　Edwards”氏抗血清做进一步试验。 4、 Spicer-Edwards血清试验 用这个实验可代替多价H血清试验，也可用来对于多价H血清反应不明显的培养物的进一步的实验。如E、3b所述，进行Spicer-Edwards抗原实验，当结果是H血清阳性时，需按E、5a-c进行生化实验；如果两个经过甲醛处理的培养物是阴性的，按E、3a得到的四个额外的培养物进行血清学实验，如果可能，获得两个阳性培养物，按E、3a进行附加的生化实验，如果所有的来自于样品的尿素酶阴性反应的TSI培养物的H血清实验是阴性的，按E、5a-c进行附加的生化实验。 5、 尿素酶阴性培养物试验. a、 赖氨酸脱羧酶肉汤。如果所做的LIA试验是满意的，则不需重复试验。如果培养物呈现可疑的LIA反应，则以赖氨酸脱羧酶肉汤进行赖氨酸脱羧酶的最终鉴定。将少量可疑沙门氏菌阳性TSI琼脂斜面培养物接种至赖氨酸脱羧酶肉汤管。将试管帽旋紧，置于35℃培养48±2小时，至少每隔24小时检查一次。沙门氏菌因碱性反应，则使整个培养基呈紫色。阴性反应则使整个培养基呈黄色。如果培养基出现褪色现象（即不呈紫色也不呈黄色），可加入几滴0.2%溴甲酚紫溶液，然后再观察试管的反应。 b、 酚红卫茅醇肉汤或含有0.5%卫茅醇的紫色肉汤基础液。由TSI琼脂上取少量培养物接种至肉汤管中。将试管帽放松。置于35℃培养48±2小时，但24h后观察反应。大多数沙门氏菌呈阳性实验结果，表现为内部发酵管中产气和培养基变酸（黄色）。产酸为阳性反应。阴性反应为倒管内无气体产生。整个培养基呈红色（有酚红指示剂）或紫色（有溴甲酚紫指示剂）。 c、 胰蛋白胨（或色氨酸）肉汤。将少量TSI琼脂培养物接种到肉汤管中，置35℃培养24±2小时，并按以下进行试验。 1) 氰化钾（KCN）肉汤。从24h色氨酸培养物移取3mm接种环一环转种到KCN肉汤管中。将管口加热，以便加塞时蜡封良好。35℃培养48±2小时，但24h后观察反应。有生长者（有浑浊）为阳性。大多数沙门氏菌在此培养基中不能生长，即无浑浊现象。 2) 丙二酸盐肉汤。用3mm接种环移取24h色氨酸肉汤培养物，转种到丙二酸盐肉汤管中。因偶尔会出现未接种的丙二酸盐肉汤在存放期间变兰（阳性反应），所以应有未接种的丙二酸盐肉汤管作对照。35℃培养48±2小时，但在培养24h后观察反应。大多数沙门氏菌培养物在此肉汤中为阴性反应（绿色或不变色）。 3) 吲哚试验。转种5mL24h色氨酸肉汤培养物到空试管中，加入0.2-0.3mLKovacs氏试剂，大多数沙门氏菌培养物为阴性反应（在肉汤表面无深红色）。并记录呈桔色和粉色变化的中间型为±反应。 4) 沙门氏菌血清学鞭毛（H）试验。如果未做多价鞭毛（H）试验或Spicer-Edwards氏鞭毛（H）试验，可任选其一。 5) 吲哚试验阳性和血清学鞭毛（H）试验阴性；或者KCN试验阳性和赖氨酸脱羧酶试验阴性的非沙门氏菌任一培养物予以去除。 6、 沙门氏菌血清学菌体（O）试验。 （用已知沙门氏菌培养物同所有抗血清做予试验）。 a、 多价菌体（O）试验：用蜡笔在每个玻璃或塑料平板（15×100mm）内侧划出2个约1×2cm的区域。可使用商品化的分区载玻片，用2mL0.85%生理盐水乳化从24-48hTSI斜面或者更好是胰胨血琼脂基础（无血），用3mm接种环移取培养物。加1滴菌悬液于用蜡笔标出的每一矩形区域的上部。这一区域的下部加1滴生理盐水。在另一区域加1滴沙门氏菌多价菌体（O）抗血清。再以干净灭菌的接种环或针将一个区域内的菌悬液和生理盐水混合。在另一区域内菌悬液和抗血清液混合。将混合液前后倾斜移动1min，并在良好照明下对着黑暗背景观察，任何程度的凝集都视为阳性反应。多价菌体（O）试验结果分类如下： 阳性反应：混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集。 阴性反应：混合物试验不凝集，在盐水对照中也不凝集。 非特异性反应：混合物试验和盐水对照中皆凝集，需按Edwards和Ewing氏的肠杆菌科鉴定中所描述的进一步作生化学和血清学试验。 b、 菌体(O)群试验. 如有各群菌体（O）抗血清，包括Vi，代替沙门氏菌多价菌体（O）抗血清，按上述五，5a试验。对Vi凝集反应阳性的可参照官方分析分析方法的967.28B部分专门处理这些培养物。与菌体（O）群抗血清呈阳性凝集的培养物，作该菌体（O）群阳性记录；不能与菌体（O）群抗血清发生反应者，做该菌体（O）群试验阴性记录。 7、补充生化试验. 按表1中1-11项试验，对培养物呈典型沙门氏菌反应者，进行沙门氏菌分类。如在25g分析样品中有一个TSI培养物被划为沙门氏菌，则该25g分析样品的其他TSI培养物就无需进一步试验。沙门氏菌鞭毛（H）试验阳性表明有沙门氏菌抗原，但不具有沙门氏菌生化特性者，应对培养物作纯分离（按上述五、1），按上述五、2开始重新做试验。 对表1中1-11项目，不呈典型沙门氏菌反应的培养物做以下补充试验以最终判断为非沙门氏菌。 a、 酚红乳糖肉汤或紫色乳糖肉汤。 1) 从每个尚未分类的24-48hTSI琼脂斜面上挑取少许培养物，接种到肉汤管中，35℃培养48±2h。并在24h后开始观察变化。 阳性反应：产酸（黄色）和在倒立发酵管内产气。只要产酸就视为阳性反应。大多数沙门氏菌为阴性结果。即在倒立发酵管内没有气体形成，和整个培养基呈红色（含酚红指示剂）或紫色（含溴甲酚紫指示剂）。 2) 除培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应，或丙二酸盐肉汤试验呈阳性的培养物外，弃去乳糖试验阳性的非沙门氏菌培养物。为了证明他们是否为亚利桑那菌，需对这些培养物作进一步试验。 b.酚红蔗糖肉汤或紫色蔗糖肉汤。按上述五,7a-1所叙述的程序进行，除那些培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应者外，呈蔗糖试验阳性结果者皆作为非沙门氏菌弃去。 c. MR-VP肉汤.对每个未分类的TSI琼脂斜面上可疑沙门氏菌培养物，挑取少许，接种到此肉汤管中，置于35℃培养48±2h。 1) 在室温下按下述进行Voges-Proskauer氏(VP)试验：移取1mL48h培养物于试管中，并将剩余的MR-VP肉汤于35℃再培养48h。加入0.6mLα-萘酚溶液于试管中并振摇；加40%KOH溶液0.2mL，并振摇。为了加快反应速度，加少许肌酸结晶。4h后观察结果：阳性反应为整个培养基由粉红色转变至红宝石色。绝大多数沙门氏菌VP试验阴性，即整个肉汤不呈粉红至红色变化。 2) 甲基红试验：吸取经96h培养的MR-VP肉汤5mL于试管中，加入5-6滴甲基红指示剂，立即观察结果。绝大多数沙门氏菌培养物呈阳性结果，即培养基呈弥散性红色。明显的黄色为阴性结果。对KCN阳性，V-P试验阳性及甲基红试验为阴性培养物，皆可作为非沙门氏菌弃去。 d. Simmons氏枸橼酸盐琼脂. 从未分类的TSI琼脂斜面上，用接种针沾取培养 物，划线接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，并穿刺底层。置于35℃培养96±2h， 按下述方法读取结果。 阳性反应：能生长，通常伴随颜色由绿色变兰色。大多数沙门氏菌培养物为枸橼酸盐阳性。 阴性反应：不生长或微弱生长，而且不变色。 8、培养物的分类：沙门氏菌培养物应具有表1反应模式。凡培养物具有表2所列任何一小项结果，为非沙门氏菌则弃去。对任何培养物，当不能按表1的分类表，明确地鉴定为非沙门氏菌属，或也不能根据表2所列试验反应从沙门氏菌属中排除者，可按Edwards和Ewings氏的“肠杆菌科鉴定”所述的补充试验进一步分类。如2个TSI培养物皆不能按生化试验证实分离物为沙门氏菌时，则对同一个25g检验样品中保留的尿素酶阴性TSI培养物，按五，5开始进行生化学试验。 表1.沙门氏菌的生化和血清学反应 反应和底物 结果 沙门氏菌的反应(a) 阳性 阴性 1.葡萄糖(TSI) 黄色底部 红色底部 + 2.赖氨酸脱酸酶(LIA) 紫色底部 黄色底部 + 3.H2S(TSI和LIA) 黑色 无黑色 + 4.尿素酶 紫红色 无颜色变化 - 5.赖氨酸脱酸酶肉汤 紫色 黄色 + 6.苯酚红卫茅醇肉汤 黄色(产或不产气) 不产气或无颜色变化 +(b) 7.KCN肉汤 生长 不生长 - 8.丙二酸钠肉汤 蓝色 无颜色变化 -(c) 9.吲哚试验 溶液表面为紫色 溶液表面为黄色 - 10.多价鞭毛试验 凝集 不凝集 + 11.多价菌体试验 凝集 不凝集 + 12.苯酚红乳糖肉汤 黄色(产或不产气) 不产气；无颜色变化 -(c) 13.苯酚红蔗糖肉汤 黄色(产或不产气) 不产气；无颜色变化 - 14.V-P试验 粉色至红色 无颜色变化 - 15.甲基红试验 红色 黄色 + 16.西蒙氏枸橼酸盐 生长，蓝色 不生长，无颜色变化 v a+， ≥90%阳性(1-2天内)；- ，≥90%阴性(1-2天内)；V，不稳定 b大部分亚利桑那沙门氏菌阴性 c大部分亚利桑那沙门氏菌阳性 表2.分离非沙门氏菌的关键特征 反应和底物 结果 1、尿素酶 2、吲哚 多价H血清实验 阳性（粉-红色） 阳性（粉-红色） 阴性（不凝集） 吲哚 Spicer-Edwards血清试验 阳性（粉-红色） 阴性（不凝集） 3赖氨酸脱羧酶 KCN肉汤 阴性（黄色） 阳性（生长） 4、苯酚红乳糖肉汤 阳性（黄色、有或没有气体）（a） 5、苯酚红蔗糖肉汤 阳性（黄色、有或没有气体）（a）（b） 6、KCN肉汤 V-P实验 中性红实验 阳性（生长） 阳性（粉-红色） 阴性（明显的黄色） a 丙二酸钠阳性的培养物需进行进一步的实验确定是否是S.arzonae； b 如果在LIA上有典型的沙门氏特征的培养物不要弃去，需进行进一步的实验，确定是否是沙门氏菌。 9. 沙门氏菌属的拟定性鉴定。使用5种商品化的生物化学试剂盒（API 20E, Enterotube II, Enterobacter aceae II, MICRO-ID,或Vitek GNI）中任一种，代替常规的生化管系统，鉴定拟定食源性沙门氏菌属。按本节鉴定所述，检验人员根据自己试验室选择商品试剂盒与生化管系统相适应的一种商品试剂盒。生化学商品试剂盒不能用来代替血清学试验（1）。组装试剂盒，配制试剂盒所需试剂。参照官方分析方法的978.24部分（API-20E, Enterotube II和Enterobacterlaceae II）,989.12部分（MICRO-ID）,和991.13部分（Vitek GNI）,接种于每个组合，并按规定的时间与温度进行培养。加试剂，观察与记录结果。参照上述Ref.1把培养物拟定为沙门氏菌或非沙门氏菌属。 为证实拟定为沙门氏菌的培养物，尚需进行沙门氏菌菌体（O）血清学试验，按上述五，5；和沙门氏菌鞭毛（H）血清试验，按上述五，3；或进行Spicer-Edwards氏鞭毛（H）试验。并按下列原则对培养物进行分类： a. 用商品化试剂盒拟定为沙门氏菌的培养物，若沙门氏菌菌体（O）血清学试验阳性与沙门氏菌鞭毛（H）血清学试验阳性的则报告为沙门氏菌。 b. 用商品化试剂盒确定为非沙门氏菌的培养物，参照AOAC标准（1）确定亦为非沙门氏菌，应作非沙门氏菌予以排除。 c. 凡不符合a或b的培养物，应按上述五,2-7项中有关规定作进一步试验，或按Ewing(2)氏的有关项目进一步试验，或送至标准定型实验室，做最后的血清定型与鉴定。 10. 鞭毛（H）试验阴性培养物的处理：对一些生化反应典型，被认为是沙门氏菌，但 鞭毛（H）试验阴性的培养物，可能是无动力的菌株，或鞭毛抗原发育不充分， 对此培养物的动力测定方法如下：从TSI斜面上挑取少量的培养物，接种于动力试验培养基平板中，在距平板边缘10mm处一次穿刺2-3mm深，不要刺到平板底或接种到其他任何部位。置于35℃培养24h。如果细菌游散生长至40mm或更远，按下述方法再试验：在游散生长最远处，用3mm接种环转种一环培养物至胰酪胨大豆蛋白胨肉汤中。重复沙门氏菌多价鞭毛（H）（按上述五，3）或作Spicer-Edwards氏鞭毛（H）血清学试验。如果培养物经第一个24h培养后无动力，于35℃培养24h；如果仍无动力，则置25℃再培养5天。如果上述试验仍为阴性，把该培养物定为无动力菌株。如果鞭毛（H）阴性培养物，按生化学反应可疑为沙门氏菌，应将培养物呈送微生物学实验室作进一步的鉴定和/或血清学分型。 11.血清学定型培养物递送。除非另有说明，每个检验样品要递送1个分离物。培养物要放在脑心浸液琼脂斜面的试管(13X100mm或16X125mm)内递送。试管的螺旋帽应拧紧以确保安全。试管标贴上样品编号，分析编号和密码。提交的每一个样品应有以下记录：1)收集报告 FD-464或进口报告FD-784；2)检测者的工作记录 FD-431；3)沙门氏菌的记录 FD-431g。放置培养物于培养容器内并加盖FDA印章封口，此培养物的记录(以上E-11)放在搬运箱内，但不要放在加盖FDA印章的容器内。提交关于样品编号的申请或信函，以便早日出结果，按病原微生物的运输规定进行运输。依据联邦登记以最快的方式进行运输。对于提交的样品需保留一份拷贝。 参考文献