GB4789.3-2025 大肠菌群计数—MPN计数法

一、引言

  《GB4789.3-2025 大肠菌群计数》标准已于2025.03.16发布，将于2025.09.16实施。

  新标准中对检验程序、操作步骤、结果与报告、附录都有修改。

  本文主要展示MPN计数法的流程、所用培养基、具体操作步骤和结果判断。

二、大肠菌群MPN计数法的检验程序如图所示

三、所用的培养基

（1）225mL稀释液：样品处理时，以下三种均质袋，任选其一均可。

  A：含225mL磷酸盐缓冲液均质袋

  B：含225mL 0.85%生理盐水均质袋

  C: 含225mL磷酸盐缓冲液均质袋（可立式）

（2）月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST肉汤）

干粉	即用型（含小倒管）

（3）煌绿乳糖胆盐肉汤管BGLB（10mL）

干粉	即用型（含小倒管）

四、操作步骤

（1）样品制备

  无菌操作称取25g（或25mL）样品，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min～2min,制成1∶10的样品匀液。

（2）梯度稀释

  使用成品0.85%的生理盐水管或自己配制的9 mL生理盐水试管，将样品进行梯度稀释。

（3）接种LST，进行初发酵试验

  每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管LST肉汤，每管LST肉汤接种1mL样品匀液。将已接种样品的LST肉汤管置于36℃±1℃培养24h±2h，检查产气情况。

  阳性管和阴性管的参考图示如下，菌液浑浊，且小倒管中有气泡的试管，判为阳性。

  A：产气者进行复发酵试验（确认试验）。

  B：如未产气，则继续培养至48h±2h再检查产气情况，产气者进行复发酵试验；培养至48h±2h，仍未产气者判断为大肠菌群阴性。

  C：若培养至48h±2h，所有LST肉汤管均未产气,按照附录B中的MPN 检索表，报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN 值，以MPN/g（mL）表示。

（4）接种BGLB，进行复发酵试验（确认试验）

  轻轻振摇各产气的LST肉汤管，分别用接种环取培养物1环，转种于BGLB肉汤管中，36℃±1℃培养24h±2h，检查产气情况，产气者判断为大肠菌群阳性；未产气者则继续培养至48h±2h再检查产气情况，产气者判断为大肠菌群阳性，仍未产气者判断为大肠菌群阴性。

  阳性管的参考图示如下，菌液浑浊，且小倒管中有气泡的试管，判为阳性。

（5）查表，报告结果

  根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数，按照附录B中的MPN 检索表，报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN 值，以MPN/g（mL）表示。

五、特别说明：

  1、如接种体积超过1mL，则要加到等体积的双料LST肉汤中。

  2、有关产气情况判断，通常小倒管或产气收集装置内有气泡产生，或轻轻振摇 LST 肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者，判断为产气。

  3、如连续的稀释度超过3个，根据附录C确定最适的3个连续稀释度。具体可参考：MPN计数法-确定最适的3个连续稀释度的方法-实验操作视频。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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