气相色谱法-质谱检测法

1  方法提要

根据方法进行验证修改后,并依据欧盟指令建立了质谱测定条件，将某些关键步骤进行细化。

本方法适用于水产品和畜、禽肉组织、肠衣中氯霉素残留确证检测。用乙酸乙酯提取，提取液用正己烷净化，硅烷化后用气相色谱配有负化学源的5973N质谱检测器检测。

 2  实验室设备

2.1  仪器和设备

2.1.1 Agilent6890气相色谱仪：配有负化学源的5973N质谱检测器。

2.1.2 离心机：5810型，Eppendorf公司。

2.1.3 均质器：T25型，18G 刀，IKA公司

2.1.4 旋转蒸发器：R-200，BUCHI公司。

2.1.5 移液枪：200μL、1000μL、5000μL，Eppendorf公司。

2.1.6 具塞塑料离心管：15 mL 、50 ML。

2.1.7 涡流混匀器：39760型，Thermolyne公司。

2.2  试剂

所有试剂均为分析纯级（有机试剂需重蒸馏），水为去离子水。

2.2.1  乙酸乙酯。

2.2.2  甲醇。

2.2.3  正己烷。

2.2.4  氯化钠。

2.2.5  无水硫酸钠：经650℃灼烧4 h，置于干燥器内备用。

2.2.6  硅烷化试剂： Sylon BFT {99% N,O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）{美国 Supelco产品，货号33154-u，0.1mL/ampul}。

2.3  标准物质

2.3.1  氯霉素（chloramphenicol）：纯度≥99%，Amresco分装，上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。

2.4  标准溶液的配制

2.4.1  标准储备液的配制

准确称取氯霉素标样50mg置50ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，混匀，浓度为1 mg/mL，4℃保存6个月。

2.4.2  标准工作溶液配制：

取1mL储备液用甲醇溶解定容到100Ml，此时浓度为1μg/mL，取1μg/mL 1mL定容至10mL，浓度为0.1μg/mL；取1μg/mL 0.5 mL定容至10mL，浓度为0.05μg/mL。

3  实验方法

3.1  试样制备

从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经充分混匀。用四分法缩分出不少于500 g试样，混匀，均分成两份。装入清洁容器内，加封后，表明标记。

3.2  测定步骤

3.2.1  提取与净化

称取5 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中。加入25 mL乙酸乙酯，用均质器均质提取2 min，4000 r/min离心3 min。将乙酸乙酯层移入50 mL鸡心瓶中，试样再加入5 mL乙酸乙酯，涡流混匀器混匀1min，合并乙酸乙酯提取液，于40℃旋转蒸发至近干。

加入1 mL甲醇溶解残渣，再加入20 mL 4% 氯化钠溶液和15 mL正己烷，用涡流混匀器混合1 min，4000 r/min离心3 min。弃去正己烷层，水层加15 mL正己烷，同上操作，弃去正己烷层。水层中加入15 mL乙酸乙酯，用涡流混匀器混合2 min，3000 r/min离心3min。吸取乙酸乙酯层，通过无水硫酸钠柱（5g）脱水于另一个50 mL鸡心瓶中，用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱。于40 ℃旋转蒸发至约1 mL。

3.2.2  衍生化

将浓缩液移入5 mL离心管中，用1 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯。于40℃吹氮气蒸发至干。加入100 µL正己烷和100 µL硅烷化试剂，于70℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6：4），混匀溶解，供气相色谱测定。

3.2.3  测定

3.2.3.1  气相色谱条件

a) 色谱柱：30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，HP-5MS； 

c) PTV进样口温度：70℃(1.0 min)700℃/min  250℃(6.0 min) 700℃/min  300℃；

d) 载气：氦气，恒压模式，柱头压 10psi；

e) 进样量：2uL

3.2.3.2  质谱条件

a) 传输线温度：280°C

b) 溶剂延迟：  5min

c) 离子源温度：150°C

d) 四极杆温度：100°C

e) 反应气：甲烷，流量：2ml/min

f) 选择离子监测  

目标物               监测离子

氯霉素           466，468，470，376

其中定量离子为466，定性离子为468，470，376

g) 离子停留时间：60毫秒

 

3.2.3.3  标准溶液的衍生化

取适量标准溶液，用氮气吹干，加入200 µL正己烷和100 µL硅烷化试剂，于80℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6:4），混匀溶解，供气相色谱-质谱测定。在上述色谱条件下：氯霉素保留时间为 11.65 min。

3.2.3.4  样品测定

分别注射等体积的标准工作液、试剂空白、阴性控制样品、待检样品（不超过10个）、阴性控制和阳性控制样品，按上述色谱条件测定，峰面积定量。  

4、气相色谱-质谱定性

(1)保留时间定性：在上述条件下,目标化合物的保留时间为11.65±0.1min

 (2)质谱确证

在保留时间窗口内出现色谱峰后，获取其质谱图，扣除本底后如果以下判别标准全部符合，则可判定氯霉素存在：

所有4个监测离子全部在质谱图中出现

离子466为基峰和定量离子，其它3个离子与基峰丰度之比应符合如下标准

质荷比 标准丰度比（%）   允许相对偏离范围（%）   

468 76  ±20  

470 18  ±30  

376 20  ±25  

5、质量控制

每组实验除标准、样品，需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样品实验。

5.1 溶剂空白

不加试样，用与样品相同的方法进行处理。

5.2 阴性控制样品

称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用与样品相同的方法进行处理。

5.3 阳性控制样品

称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用微量注射器加入0.1µg/mL的氯霉素标准工作液25 µL，相当于样品浓度0.5ng/g用与样品相同的方法进行处理。用相同浓度的标准进行定量，计算回收率，用来判断本组操作的可靠性。

6  结果计算

6.1 外标法定量

 用色谱数据处理机或按下列公式计算：

                  

式中：X—— 试样中氯霉素药物残留含量，mg/kg；

A—— 样液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；

AS——标准工作溶液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；

  c—— 标准工作溶液中氯霉素的浓度，µg/mL；   

V—— 最终样液的定容体积，mL；

   m—— 最终样液所代表试样量，g。

计算结果需扣除空白值。

 

7 测定低限

本方法氯霉素的测定低限为 0.2 µg/kg.

8 可接受的检验结果

在添加浓度0.5μg/kg时，回收率，50%~120%。

9 检测报告

按照SPSBA00024检验报告管理程序执行。

10 方法验证

10.1 取相当于1μg/g的氯霉素衍生化物，在200-600M/z范围，进行全扫描分析，确定定量离了和确证离子及其丰度比，见附录1。

 

10.2 标准工作曲线

用注射器分别移取0.05µg/mL ，20µL 、30µL、60µL；0.1µg/mL，50µL, 1µg/mL, 25µL、标准工作液置于6个5ML 离心管中，氮气吹干，其系列分别相当于样品中0.2、0.3、0.4、1、5 ng/g的浓度。

分别注射等体积的标准工作液按给定的色谱条件进行测定，用GC-NCI-MS测定。记录峰面积，以峰面积为纵坐标，目标化合物浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，计算线性关系，得到相关系数，结果见附录2。

10.3  回收率实验和室内精密度实验

以阴性控制样品为测试样品，添加水平分别为0.2μg/kg，0.3μg/kg， 0.4μg/kg，做6个平行样，共做三次，用对应工作曲线计算每个样品的浓度，并计算回收率、标准偏差和变异系数。