1.范围

本操作规程规定了霍乱病人、密接和带菌者等粪便标本中的霍乱弧菌的检验方法。

2.检验依据

国家传染病诊断标准：GB  15984—1995

卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版

3.设备和材料

3.1  冰箱： -20℃～4℃。

3.2  恒温培养箱： 36±1℃。

3.3  暗视野显微镜： 10×～100×。

3.4  架盘药物天平： 0g～500g,  精确至0.5g。

3.5  锥形瓶： 100 mL、500 mL。

3.6  灭菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。

3.7  灭菌平皿： 直径90 mm。

3.8  灭菌试管： 16 mm×160 mm.。

3.9  洁净的载玻片。

3.10            洁净的盖玻片。

3.11            接种环。

3.12            生物安全柜：Ⅱ级。

4.培养基和试剂

4.1碱性蛋白胨水。（pH8.4-8.6，8-10 mL）

4.2庆大霉素琼脂。（培养基加热煮沸3次；一份标本用一块90mm平皿）

4.3霍乱弧菌诊断血清：Ｏ１群和Ｏ１３９群霍乱弧菌诊断血清（标明名称、日期；稀释后的诊断血清放4-8℃保存，当年使用；未稀释的诊断血清冷冻保存，有效期内使用。）

5．检验程序:霍乱弧菌检验程序见图1（略）。       

6．操作步骤

6.1 快速试验：为辅助诊断；其结果只是初步报告，不是确诊报告。

6.1.1 动力及动力抑制试验：

6.1.1.1 如是急性期病人的水样便或米泔样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水1滴在玻片上，用接种环取成形便1环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本（就诊前水样便已服药就诊时为成形便）可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。

6.1.1.2 动力试验阳性的标本，则各取O1和O139群霍乱弧菌诊断血清放置玻片上，取标本在血清中研匀（要求先取诊断血清再取标本，诊断血清与标本比例2：1），盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。

6.1.1.3 动力试验和动力抑制试验结果可口头报告，但不能确诊报告。双阳时口头报告辖区CDC高度可疑。

6.2 分离培养

6.2.1  粪便：所有病人粪便都应接种碱性蛋白胨水增菌37℃培养6～8h；未服药急性期病人取水样便或米泔样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；增菌后平稳地从温箱取出试管架，在菌膜下表层或菌液下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成。37℃过夜培养，不超过20h。

6.3  血清鉴定分型

6.3.1 血清玻片凝集试验：挑取略带灰色或青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润的可疑菌落与01群霍乱弧菌多价诊断血清及0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。要求每一平皿挑9-10个可疑菌落。如可疑菌落在血清中很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告未检出01群及0139群霍乱弧菌。

7．质量控制

7.1用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上消毒，避免交叉污染。

7.2玻片凝集试验阳性时，一定同时做生理盐水对照。在生理盐水中不凝集者，方可判断为阳性。

7.3 标本、增菌管、培养平皿要严格编号，标记清晰，避免结果错报。

7.4诊断血清、培养基保存在指定温度范围内；诊断血清要在有效期内使用。

8．生物安全

8.1标本检测要穿实验专用服、戴口罩、帽子、手套，用过的口罩、帽子、手套放黄色污物袋中，及时高压处理。

8.2用过的玻片及时放入消毒缸中浸泡；实验完毕，用浸泡消毒液的抹布擦拭实验台面，或紫外线照射消毒。

8.3 消毒制品要有有效的批准文号，在有效期内使用。 配制的消毒使用液，要表明配制日期。

8.4 标本、培养物、实验废弃物等，要经高压消毒处理后，方可丢弃。