从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒
2011-9-23 16:26:18 生物在线
一、材料：
1、缓冲液和溶液：
氯仿
NaCl（固体）
聚乙二醇（PEG 8000）
SM
2、酶和缓冲液：
胰Dnase I (1mg/ml)
胰Dnase I (1mg/ml)于TE中（ph7.6）
3、离心机和转子：
Sorvall GSA 转子或相当型号
4、专用设备：
量筒（2L）
载体和菌株：
大肠杆菌培养物，经λ噬菌体感染和裂解
二、方法：
用PEG沉淀噬菌体颗粒
1、 将含有λ噬菌体的裂解培养物冷却至室温，加胰Dnase I和Dnase 至终浓度约为1ug/ml，室温温育30min。
2、 每500ml培养物加入29.2固体NaCl（终浓度为1mon/L），搅拌使其溶解。将培养物冰浴1h。
3、 4℃，11000g（8300r/min于Sorvall GSA转子中）离心10min以去除细胞碎片，将四份培养物的上清混合置于2L的干净量筒中。
4、 测定所收集上清的总体积，然后转移至2L的烧瓶中，加固体PEG至终浓度为10%（m/V，加500ml上清加50gPEG），于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解PEG。
5、 将噬菌体/PEG溶液转移至聚丙烯离心管中，于冰水浴冷却，至少放置1h以便使噬菌体颗粒发生沉淀。
6、 4℃，11000g（8300r/min于Sorvall GSA转子中）离心10min以回收沉淀的噬菌体，去上清，将离心管倒过来倾斜放置5min，以便是剩余液体充分流干。用移液器吸取残余的液体。
用氯仿抽提细菌碎片：
7、 用一带橡皮球的宽口吸干将噬菌体沉淀轻轻地重悬于SM中（针对步骤3每500ml上清加8ml SM），将离心管倾斜放置，使SM完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀，室温放置1h。
通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s。4℃，3000g（4300r/min于Sorvall GSA转子中）离心15min以分离有机相和亲水相，回收含噬菌体颗粒的亲水相。
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