引言

  微生物基因编辑是通过人工手段对微生物（如细菌、酵母等）的基因组进行精确修改的技术，其核心原理是利用特定的工具靶向定位基因组中的目标位点，并通过DNA的切割和修复机制实现基因的插入、删除或替换。

一、微生物基因编辑技术介绍

  基因编辑的核心步骤

  1.靶向定位

  工具选择：使用特定分子工具（如CRISPR-Cas系统、锌指核酸酶ZFN、TALEN等）精准识别基因组中的目标DNA序列。

  2.DNA切割

  双链断裂（DSB）：核酸酶（如Cas9）在靶点处切割DNA双链，形成双链断裂。

  单链切割：某些工具（如Cas9 nickase）仅切割单链，降低脱靶风险。

  3.DNA修复与编辑

  DNA断裂后，细胞会启动修复机制，利用以下两种途径实现基因编辑：非同源末端连接（NHEJ）：直接修复断裂的DNA，但可能引入插入或缺失，导致基因敲除。用于破坏特定基因功能；同源定向修复（HDR）：以提供的同源修复模板（供体DNA）为参考，精确插入或替换目标序列。用于基因敲入、点突变或大片段插入。

二、基因编辑工具的迭代

  1.传统同源重组

  同源重组（Homologous Recombination）是一种依赖DNA序列同源性进行精确修复或重排的分子机制，广泛存在于细菌、酵母、动植物等生物中。在基因编辑中，同源重组被用于通过人工设计的同源修复模板（供体DNA）对目标基因组进行精准修改，如基因敲入（Knock-in）、点突变或大片段替换。

  2.CRISPR-Cas系统

  CRISPR/Cas9系统：利用向导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白协同作用，通过PAM序列定位靶点，实现精准切割。操作简便、成本低、效率高，是目前最主流的基因编辑工具。其大致流程为：设计gRNA，使其与目标DNA序列互补；将gRNA与Cas9蛋白（或编码质粒）导入微生物细胞；Cas9-gRNA复合体切割靶DNA，触发修复机制；结合供体DNA模板实现精确编辑。

  3.转座子与重组酶系统

  利用转座酶（如Tn）或位点特异性重组酶（如Cre-LoxP系统）实现DNA片段的插入或删除。

  转座酶为执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。

  特异性重组酶Cre酶是一种特异性重组酶，其在作用时重组率更高。比如构建的质粒的同源臂上存在两处loxP位点，分别位于待敲除基因的两端，而Cre拥有不需要factor就能将loxP位点间基因进行敲除和重组的能力，无需双链断裂，但编辑位点受限于酶的特异性。

三、微生物基因编辑的验证

  1.分子水平验证

  1）PCR扩增与电泳分析：检测目标基因是否被插入、删除或替换。

  2）测序分析：确认编辑位点的序列准确性，排除非预期突变。

  3）qPCR或数字PCR：检测基因拷贝数变化。

  4）蛋白水平验证（Western Blot）：确认目标基因的表达变化（如基因敲除后蛋白缺失，或外源基因表达）。

  2.表型水平验证

  1）抗性筛选与菌落PCR：结合选择标记（如抗生素抗性基因）筛选阳性克隆，并进一步验证。

  2）功能表型检测：通过生物学功能变化确认基因编辑效果。代谢缺陷，若敲除某代谢基因，菌株可能在特定培养基上无法生长；或基因表达，插入荧光蛋白或酶基因，通过显色或荧光观察表达情况。

  3）微生物生长曲线分析：检测编辑是否影响微生物的生长特性。

  3.其他验证技术

  1）荧光报告系统：实时监测基因编辑效率，构建含荧光蛋白（如mCherry）的报告质粒，当编辑工具激活时荧光信号消失或增强。

  2）单菌落分离与纯化：避免混合克隆干扰验证结果，将转化后的菌液稀释涂板，挑取单菌落扩增后验证。

四、结语

  微生物基因编辑的核心在于精准靶向、可控切割和高效修复。CRISPR技术的出现大幅提升了编辑效率和灵活性，但不同微生物需适配特定工具和条件。未来随着合成生物学和基因递送技术的进步，微生物基因编辑将在生物制造、医疗健康等领域发挥更大作用。

五、微生物基因工程相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有各种基因工程相关培养基，欢迎广大新老客户采购使用。

注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。