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在微生物学研究与工业应用中，培养基是支持微生物生长、繁殖及代谢活动的基础物质。作为培养基的重要组成部分，染料通过其独特的理化性质，不仅能够通过颜色变化直观反映微生物的代谢特性，还能通过选择性抑制或指示作用区分不同种类的微生物。本文将从染料的种类、理化特征、溶解方式、变色范围及其在培养基中的具体功能进行系统性阐述，并结合实际案例探讨其应用价值。
一、染料的分类
1、按来源分类：分为天然染料和合成染料。天然染料如苏木精（Haematoxylin）和靛蓝（Indigo），早期曾用于染色技术，但因稳定性差、色域有限，在微生物学中已逐渐被合成染料取代；合成染料占现代实验室用染料的90%以上，包括酸性染料（如伊红Y）、碱性染料（如亚甲蓝）、中性染料（如中性红）等，具有高纯度、稳定性和可定制性。
2、按功能分类：可分为以下几类
（1）酸碱指示剂（pH Indicators）
这类染料通过颜色变化反映微生物代谢引起的培养基pH变化，常用于鉴定产酸或产碱菌。例如：酚红（Phenol Red），pH敏感范围为6.8（黄色）至8.4（红色）。在碳水化合物发酵试验中，若微生物分解糖类产酸，培养基会变黄；若分解蛋白质产碱，则呈红色。溴甲酚紫（Bromocresol Purple）：变色范围为pH5.2（黄色）至6.8（紫色），常用于乳糖发酵管，区分大肠埃希氏菌（产酸变黄）与产气肠杆菌（产碱保持紫色）。
（2）代谢产物指示剂
通过检测特定代谢物（如硫化氢、氧化酶）的存在与否，辅助菌种鉴定。例如：中性红（Neutral Red），在伊红美蓝琼脂（EMB）中，中性红与乳糖发酵产生的酸结合，使大肠埃希氏菌菌落呈绿色金属光泽。TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）：无色水溶液，被微生物还原后生成红色甲臜沉淀，用于快速检测活菌数量或区分需氧/厌氧菌活性。
（3）氧化还原指示染料
大多数是结构复杂的有机化合物，有的是氧化剂，有的是还原剂，而指示剂的氧化态和还原态具有不同的颜色，可显示氧含量或代谢活性。例如：刃天青（Resazurin）：在缺氧条件下被还原为粉红色的试卤灵（Resorufin），用于指示培养基中的氧含量。亚甲基蓝（Methylene Blue）：氧化态为蓝色，还原态为无色，常用于厌氧培养基中判断氧化还原状态。
（4）选择性抑制剂染料
通过抑制特定微生物生长，实现选择性分离。例如：结晶紫（Crystal Violet），在麦康凯琼脂中，抑制革兰氏阳性菌（如葡萄球菌），仅允许革兰氏阴性菌（如大肠埃希氏菌）生长。孔雀石绿（Malachite Green），用于选择性培养基（如Lowenstein-Jensen培养基），抑制非分枝杆菌的生长，促进结核分枝杆菌的分离。
（5）显色底物（Chromogenic Substrates）
特定酶作用下释放显色基团，用于快速鉴定。例如：X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），被β-半乳糖苷酶水解后生成蓝色产物，用于筛选携带lacZ基因的克隆。MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷），大肠埃希氏菌的β-葡萄糖醛酸酶分解MUG释放荧光物质，用于快速检测水质污染。
（6）荧光染料
通过荧光标记技术检测微生物特定结构或代谢活动。例如：DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），与DNA双链结合后发出蓝色荧光，用于直接计数环境样本中的微生物。SYBR Green，实时定量PCR中结合双链DNA，荧光强度反映核酸扩增量。
二、特征与溶解方式
1、理化特征
（1）极性差异：酸性染料含磺酸基（-SO3H）或羧基（-COOH），易溶于水；碱性染料含氨基（-NH2），需酸性条件溶解。
（2）光热稳定性：如酚红在高温灭菌（121℃）下易分解，需过滤除菌后添加；溴甲酚紫则耐高温。
（3）毒性控制：部分染料（如孔雀石绿）因潜在致癌性已被禁用，需选择低毒替代品。
（4）显色灵敏度：染料需在特定浓度范围内呈现可识别的颜色变化。例如，中性红在pH6.8（红色）至pH8.0（黄色）之间变色，可灵敏指示微生物代谢引起的pH变化。
2、溶解方式
染料的溶解方式直接影响其在培养基中的均匀性和功能发挥。不同染料的溶解特性差异显著，需根据其化学性质选择溶剂和溶解条件：
（1）溶剂选择
水溶性染料：如酚红、溴甲酚紫，可直接溶于蒸馏水或缓冲液。
脂溶性染料：如苏丹黑，需先用有机溶剂（如乙醇、丙酮）溶解，再与培养基混合。
复合溶剂：某些染料需混合溶剂溶解。例如，刃天青需先溶于少量乙醇，再用水稀释。
（2）溶解温度与pH调节
部分染料需加热促进溶解。例如，琼脂培养基中的溴甲酚紫需在沸水中充分溶解以避免沉淀。pH值对染料溶解度和稳定性至关重要。例如，亚甲基蓝在酸性条件下易沉淀，需在pH7.0以上环境中使用。
（3）灭菌后的添加
热敏感染料需在培养基灭菌后冷却至适宜温度（约50℃）时加入，避免高温破坏其结构。
三、染料选择的科学依据
1、微生物类型：选择染料需考虑目标菌的细胞壁结构（如革兰氏染色特性）、代谢途径（如是否产酶）及抗逆性。
2、检测目标：若需观察生长抑制效果，优先选用选择性染料（如结晶紫）；若需定量代谢活性，则选择TTC等还原性染料。
3、兼容性：染料需与培养基其他成分（如碳源、抗生素）兼容，避免沉淀或失活。例如，高温灭菌可能分解TTC，需采用过滤除菌。
4、安全性与成本：孔雀石绿因潜在致癌性已逐渐被替代；商业显色培养基成本较高，需权衡实验需求。
四、使用染料的注意事项
1、浓度控制：过量染料可能抑制微生物生长（如0.1%以上的结晶紫完全抑制革兰氏阳性菌）。
2、稳定性：部分染料遇光分解，需避光保存。
3、干扰因素：血液或血清可能吸附染料，影响显色效果。
4、废液处理：含染料的培养基需按危险废弃物处理，避免环境污染。
五、常见染料的应用实例
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染料 |
类型 |
溶解方式 |
变色/作用机制 |
热稳定性 |
光稳定性 |
应用实例 |
安全注意事项 |
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酚红 |
pH指示剂 |
微溶于水，易溶于乙醇和碱溶液 |
pH值6.8→8.4 黄→紫红 |
常温下相对稳定，温度过高可能分解 |
光照下易分解 |
糖发酵试验、 |
对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，操作时建议佩戴防护用具 |
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中性红 |
代谢显色剂 |
水、乙醇 |
pH值6.8-8.0 红→黄 |
高温分解（>100℃） |
对光敏感 |
对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，操作时建议佩戴防护用具 |
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伊红 |
代谢产物指示剂 |
溶于水、乙醇 |
酸性条件稳定 |
高温分解（>80℃） |
光稳定性一般 |
对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，操作时建议佩戴防护用具 |
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苏丹红 |
脂溶性染料 |
溶于脂类、丙酮 |
主要用于染色脂肪，无显著pH响应 |
耐高温（<200℃） |
光稳定性较差 |
用于生物组织中脂肪的染色鉴定，如脂肪细胞、脂肪滴等的染色 |
部分衍生物有致癌风险，操作时需格外谨慎，做好防护措施，避免接触和吸入 |
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甲基红 |
pH指示剂 |
溶于乙醇 |
pH值4.4→pH6.2 红色→黄色 |
高温分解 |
遇光分解 |
操作时需格外谨慎，做好防护措施，避免接触和吸入 |
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溴甲酚紫 |
pH指示剂 |
乙醇或碱性水溶液 |
pH值5.2→6.8 黄→紫 |
高温分解 |
光稳定性较差 |
对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，操作时需注意防护 |
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刃天青 |
氧化还原指示剂 |
乙醇+水稀释 |
氧化态（蓝色）、还原态（粉红） |
常温稳定 |
对光敏感 |
对眼睛和皮肤有刺激性，操作时注意防护 |
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亚甲基蓝 |
选择性抑制剂、氧化还原指示剂 |
易溶于水或乙醇 |
氧化态（蓝色）、还原态（无色） |
高温分解（>190℃） |
遇光分解 |
对眼睛和皮肤有刺激性，避免吸入和接触 |
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TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑） |
代谢产物指示剂 |
溶于水或乙醇 |
无色（氧化态）→红色甲臜（还原态） |
高温分解 |
对光敏感 |
细菌活细胞检测（活菌还原TTC显红色斑点） |
对眼睛和皮肤有刺激性，操作时需注意防护 |
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结晶紫 |
选择性抑制剂、染色剂 |
水或乙醇 |
酸性条件下变色 抑制革兰氏阳性菌 |
耐高温（<150℃） |
光照下易分解 |
可能致突变，戴手套操作，避免接触和吸入，防止污染环境 |
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X-Gal |
代谢显色剂 |
DMF或DMSO |
被β-半乳糖苷酶水解显蓝色 |
高温分解 |
对光敏感 |
蓝白斑筛选（lacZ基因） |
对眼睛和皮肤有刺激性，操作时使用DMF或DMSO等溶剂需注意其毒性，做好防护 |
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刚果红 |
pH指示剂 |
溶于水、乙醇 |
pH值3.0→5.2 蓝→红 |
高温分解（>120℃） |
光稳定性较差 |
纤维素染色、淀粉检测 |
可能有致癌风险，操作时需谨慎，做好防护措施，避免接触和吸入 |
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溴酚蓝 |
pH指示剂 |
易溶于水、乙醇 |
pH值3.0→4.6 黄→蓝 |
耐高温（<180℃） |
光照下稳定 |
电泳指示剂、pH指示剂 |
低毒，但仍应避免长期接触，操作时建议佩戴手套 |
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煌绿 |
pH指示剂 |
可溶水和乙醇 |
pH值0.13→2.0 黄色→绿色 |
高温分解 |
光稳定性一般 |
对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，操作时需注意防护 |
*表中列举染料为部分常用染料，资料来源网络，仅供参考。
注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。
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